Método de preservación de espermatozoides de abalón para la industria acuícola.

La presente invención se relaciona con un método de preservación de espermatozoides de abalones,

en particular de abalón verde Haliotis discus hannai y rojo H. rufescens, que comprende mezclar los espermatozoides con un crioprotectante que comprende propilenglicol, sacarosa y yema de huevo; congelar los espermatozoides con el crioprotectaifie hasta una temperatura de alrededor de- 40°C y almacenarlos en nitrógeno líquido. El método también comprende el descongelamiento de las muestras de espermatozoide.

Método de preservación de espermatozoides de abalón para la industria acuícola.

La presente invención se relaciona con un método de criopreservación de espermatozoides de abalones, en particular de abalón verde Haliotis discus hannai y rojo H. rufescens. La invención busca optimizar e innovar en alternativas tecnológicas utilizando material genético mejorado. El método de la invención está dirigido en particular a la criopreservación de espermatozoides de abalones provenientes de ejemplares con características altamente valiosas (CAV) para los cultivos de producción comercial.

La técnica permite criopreservar, por largos periodos de tiempo, espermatozoides portadores de genes que expresen determinadas características, tales como tasas de crecimiento, coloración, etc. En los espermatozoides de abalones con CAV se pueden seleccionar caracteres como la mayor motilidad, supervivencia y tasa de fecundación, que aseguran lotes exitosos.

Los protocolos de criopreservación comprenden por una parte la selección de crioprotectores y criopreservantes, la concentración de estos, temperaturas óptimas de transición y tiempos de congelación y descongelación.

La tecnología permite preservar dosis de espermatozoides para realizar fecundaciones en cualquier momento que se requiera, especialmente cuando el número de reproductores son limitantes ya que en general no todos los reproductores inducidos al desove responden. El método de la presente invención facilita el trabajo del cultivo larvario en los hatcheries al independizar la producción del ciclo reproductivo natural de los machos.

Arte Previo En peces existen más de 200 estudios sobre criopreservación de espermatozoides. Los más relevantes se sintetizan en el trabajo de Rana, K.1995. Cr y opreservation of fish spermatozoa, en: Methods in molecular biology: Cr y opreservation and freeze-dr y ing protocols. Eds. J.G.Day, M.R y McLellan. Vol. 38, pp 151-165.

En Invertebrados marinos se han publicado cerca de 30 estudios de criopreservación de espermatozoides dentro de éstos citamos los siguientes que se refieren específicamente a abalones.

Gwo, J., C.Chen &H, Cheng. 2002. Semen cr y opreservation of small abalone (Haliotis diversicolor supertexa) . Theriogenology, 58: 1563-1578.

Salinas L., C. Paniagua, A.Jenkins, T. Tiersch. 2005. Cr y opreservation of sperm of red abalone. Journal of Shellfisheries Research 24 (2) : 415-420

El trabajo de Salinas et al (2005) es el único que se refiere a una de las especies consideradas en esta patente (abalón rojo) . De ambos estudios señalados anteriormente ninguno de ellos ha escalado a un nivel productivo, siendo los resultados aplicables sólo a pequeñas escalas. Este punto es de vital importancia, ya que el desarrollo de un método de criopreservación a escala productiva, requiere de una mayor investigación y desarrollo de los resultados obtenidos en la etapa de laboratorio, y en general, varias etapas del método desarrollado a nivel de laboratorio requieren de un ajuste no trivial para ser aplicables a nivel industrial. Además, Salinas et al (2005) evalúan las propiedades de los crioprotectantes: dimetil sulfóxido (DMSO) , propilenglicol (PG) y glicerol sin ningún aditivo (como yema de huevo) . De dicho estudio, sólo coincide el crioprotector propilenglicol con de la presente invención, sin embargo las concentraciones usadas en los crioprotectores tampoco coinciden con la presente invención. El programa de congelamiento que Salinas et al (2005) divulgan tampoco es similar al programa de congelamiento descrito en la presente invención.

Los siguientes estudios, realizados en ostras y ostiones, determinan la movilidad espermática sin distinguir si este movimiento es lento o rápido o cual es su velocidad de desplazamiento. Ninguno de ellos basa la adecuación de las concentraciones y tiempo de equilibrio del crioprotector en parámetros espermáticos antes y después de la congelacióndescongelación como la distancia que se desplazan y la velocidad con que se desplazan como lo hace el método de la presente invención.

Faure C., Devauchelle N. & J. Girard. 1994. Ionic factors affecting motility, respiration and fertilization rate of the sperm of the bivalve Pecten maximus (L.) . J. Comp. Physiol., 164: 444 – 450.

Dong, Q., B. Eudeline, S.K. Allen Jr.& T.R. Tiersch. 2002. Factors affecting sperm motility of tetraploid Pacific oysters, J. Shellfish Res., 21: 719-723.

Dong, Q., B. Eudeline, C. Huang, T.R. Tiersch. 2005b. Standardization of photometric measurement of sperm concentration from diploid and tetraploid Pacific oysters, Crassostrea gigas (Thunberg) , Aquaculture. Research., 36: 86

93.

El método usado más frecuentemente para medir la motilidad, es una evaluación visual directa bajo microscopio con ayuda de una cámara Neubauer.

Dong, Q., Ch. Huang, B. Eudeline, & T. Tiersch. 2005c. Systematic factor optimization for cr y opreservation of shipped sperm samples of diploid pacific oyster Crassostrea gigas. Cr y obiology, 51, 176-197.

Existen tres patentes relacionadas con la invención, Patente US Nº US6054317, Patente GB Nº WO9806255, y Patente GB Nº WO9101636. Ninguna de estas patentes tiene relación con abalones de las especies consideradas en el presente estudio.

El resumen titulado “Protocols for haliotis rufescens egg cr y opreservation and in vitro fertilization, year 2”, correspondiente al segundo año de un proyecto estudiantil bajo el programa de “California State Science Fair”, publicado en el año 2007 describe la criopreservación de ovocitos de abalón rojo con un crioprotectante que contiene sólo PG en comparación con otro crioprotectante que sólo contiene DMSO. Los resultados que se muestran son bastante limitados en cuanto al tiempo del estudio y de las condiciones de operación, por lo que no puede compararse con la presente invención, aparte de estar dirigido a la conservación de ovocitos.

Y la solicitud de patente WO2007146344A, solicitada en el año 2007 que divulga una composición para preservación criogénica de esperma, que comprende por lo menos un crioprotectante, seleccionado entre azúcar, rafinosa, lactosa, trehalosa, melibiosa, melecitosa, manotriosa, estaquiosa, dextrano, hidroxi-etil almidón, sucrosa, maltitol, lactitol, glicerol, polialcoholes y otros seleccionado del grupo de polietilenglicol, DMSO, etilen glicol, propilenglicol, polivinil pirrolidona, glicerol y óxido de polietileno; por lo menos un protector de membranas (yema de huevo) y por lo menos un depurador de radicales libres (agente reductor) no combina los agentes crioprotectantes de la manera en que se hace en la presente invención, y donde la combinación de la presente invención ha demostrado ser superior a lo descrito en los ejemplos de la solicitud de patente WO2007146344A.

Lo que señala la patente anteriormente mencionada, es que permite una mejor sobrevivencia espermática sólo de espermatozoides criopreservados de mamíferos (especialmente roedores y bovinos) aun cuando señala que puede ser utilizado en otros animales como felinos, caballares, aves y peces de acuarios, pero en ningún caso es utilizados en invertebrados y menos en invertebrados marinos como lo que propone la presente invención. Los porcentajes obtenidos en vertebrados, según lo que señala la patente mencionada, son mayores a los reportados en la presente invención, sin embargo la composición de las membranas plasmáticas de invertebrados marinos son diferentes de aquellas que presentan los vertebrados. Por lo cual los porcentajes de motilidad y fecundación obtenidos con ambos tipos de espermatozoides criopreservados no son comparables.

La producción de abalones depende en gran medida del material genético de los padres. La reproducción de abalones es engorrosa y requiere, cuando se realiza con métodos naturales, sincronizar a machos y hembras para lograr una fecundación exitosa.

La calidad de los ejemplares obtenidos por medio de la sincronización de los padres no siempre es homogénea y por ende, la calidad de estos abalones tendrá gran variabilidad, llegando incluso a obtener productos que no cumplen con los estándares requeridos en los distintos mercados.

Contar con un stock de esperma seleccionado de padres con características deseables, permite independizar el proceso de fecundación de la sincronización de los padres.

La criopreservación permite además de independizarse de la sincronización de los padres, seleccionar el material biológico de especimenes con características deseables para la producción, como puede ser mayor tamaño, mejor color, etc., es decir, características altamente valiosas (CAV) .

El método... [Seguir leyendo]

1.Método para preservación de espermatozoides de abalón, CARACTERIZADO porque comprende los siguientes pasos:

a.proporcionar espermatozoides de abalón a criopreservar;

b.proporcionar una solución crioprotectante que comprende propilenglicol, sacarosa y yema de huevo;

c. agregar a un volumen de los espermatozoides de la etapa (a) un volumen igual de la solución crioprotectante del punto anterior mezclando suavemente;

d.cargar en una pajuela apropiada con un volumen de entre 30 y 80 μL de agua de mar microfiltrada, luego un volumen de entre 30 y 80 μL de aire, luego un volumen de entre 100 y 500 μL de la solución con espermatozoides del punto anterior, luego un volumen de entre 30 y 80 μL de aire, y finalmente un volumen de entre 30 y 80 μL de agua de mar

microfiltrada, la pajuela es sellada, y se deja un período de equilibrio de entre 5 y 15 minutos;

e.congelar las muestras hasta una temperatura de -40°C y almacenarlas en nitrógeno líquido;

f. descongelar los espermatozoides para su uso retirando las pajuelas desde el almacenaje en nitrógeno líquido.

2.Método para preservación de la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque la solución crioprotectante comprende entre 3 y 7 M de propilenglicol, entre un 3 y 6 % en peso/volumen de sacarosa, y entre un 8 y 12% en volumen/volumen de yema de huevo.

3.Método para preservación de la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque para la congelación se usa una cámara de congelamiento programable, usando una temperatura inicial de entre 5, 5°C y 6, 5°C, bajando la temperatura hasta entre -5, 5°C y 4, 5°C usando una tasa de congelación de entre -5, 5 y -4, 5 °C/min; continuar bajando la temperatura hasta entre -38 y -42°C usando una tasa de congelación de entre -17 a -19°C/min, una vez alcanzada la temperatura de entre -38°C y -42°C sumergir en nitrógeno líquido y almacenar en nitrógeno líquido hasta su uso.

4.Método para preservación de la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque para el descongelamiento la pajuela se expone entre 1 y 5 segundos a temperatura ambiente, se sumergen inmediatamente en un baño termorregulado a una temperatura entre 45 y 55°C por un tiempo de entre 5 y 10 segundos, depositar el contenido de la pajuela en un recipiente apropiado y agregar entre 10 y 40 μL de agua de mar microfiltrada para detener el efecto crioprotector.

5.Método de preservación de las reivindicaciones 1 a 4, CARACTERIZADO porque el abalón es Haliotis rufescens.

6.Método de preservación de las reivindicaciones 1 a 4, CARACTERIZADO porque el abalón es Haliotis discus hannai.