DILUYENTE PARA SUSPENSION SEMINAL.

Diluyente para suspensión seminal.

La presente invención pertenece al campo de la veterinaria,

y en particular a la reproducción asistida. Más concretamente, la invención consiste en un diluyente de semen que comprende alginato y su utilización para la conservación de esperma y para el aumento del porcentaje de progenie con un sexo determinado.

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención pertenece al campo de la inseminación artificial de animales. Más concretamente, la invención consiste en un diluyente de semen que comprende alginato y su utilización para la conservación de esperma y para el aumento del porcentaje de progenie con un sexo determinado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

En la actualidad, uno de los mayores problemas planteados en las técnicas de inseminación artificial es la conservación del esperma (o semen) y de su poder fecundante hasta que llega el momento de la inseminación. Para solucionar este problema, habitualmente se utiliza un medio denominado "diluyente" en el cual se diluye el esperma inmediatamente después de su recogida. De esta manera, se conserva hasta el momento de la inseminación.

El tiempo de conservación que se puede obtener en presencia de diluyente depende de la especie en cuestión y de las condiciones de conservación, y en particular del tipo de diluyente escogido; dicho tiempo varía generalmente de unas horas a unos días. En algunas especies, se puede prolongar este tiempo mediante la congelación del esperma; sin embargo, esta técnica produce igualmente la destrucción o la inactivación de un número importante de espermatozoides, y por consiguiente una baja de la fertilidad del esperma. Además, existen considerables diferencias de eficacia en la conservación al utilizar el proceso de congelación según la especie animal de que se trate. A este respecto, es especialmente problemática la inseminación artificial en los cerdos ya que aunque la técnica de congelación ha significado una buena estandarización de los métodos de conservación en otras especies domesticas, es prácticamente inaplicable con el material seminal porcino. Las peculiares particularidades que presenta el espermatozoide porcino hace que sea muy sensible al shock por frío, que produce una alteración de la viabilidad espermática. Esta susceptibilidad al choque por frío, supone en la práctica que las muestras seminales deban ser conservadas a 15-20°C, ya que una reducción en la temperatura de almacenamiento limita la viabilidad de las muestras seminales (Paulenz et al., 2000) .

La presente invención se refiere a la adición de alginato a entre 0, 25 giL Y 10 giL, en diluyentes de semen convencionales (tanto de verracos como de otras especies de animales) , para mejorar la supervivencia de los espermatozoides y su comportamiento en la fecundación con miras a la inseminación artificial o cualquier otra práctica de reproducción asistida.

Son muchos los estudios que divulgan la utilización del alginato como diluyente de semen, por ejemplo en las especies caprina, ovina, bovina, y equina. Sin embargo, todos ellos requieren del proceso de encapsulación para conseguir la conservación del semen (ES2202723; EP0922451; Herrler et al., 2006) . Sorprendentemente, en la presente invención se describe el uso de alginato en solución a una concentración entre 0, 25 gil Y 10 gil que permite conservar el esperma sin necesidad de llevar a cabo el proceso de encapsulación. En el diluyente con alginato de la presente invención, no se produce o se reduce el contacto entre las células espermáticas por lo que en parte o en su totalidad éstas se mantienen en suspensión favoreciendo el contacto con el diluyente y con ello su conservación, viabilidad y capacidad fecundante, todo ello sin someterlas a las reacciones químicas requeridas para la encapsulación.

Por esperma, o semen, se entiende, en los términos de la presente invención, al conjunto de espermatozoides y sustancias fluidas que se producen en el aparato genital masculino de los animales y de la especie humana. Por diluyente de semen convencional se entiende, en los términos de esta invención, la solución acuosa que permite aumentar el volumen seminal (mayor número de dosis seminales por eyaculado) y preservar las características funcionales de las células espermáticas y mantener el nivel de fertilidad adecuado. Los espermatozoides se encuentran en el plasma seminal que suministra los nutrientes necesarios para mantener una elevada actividad metabólica necesaria para el proceso de transporte espermático a través del tracto genital femenino. Para llevar a cabo su función, el diluyente debe aportar los nutrientes necesarios para el mantenimiento metabólico de la célula espermática, controlar el pH del medio, la presión osmótica y la inhibición del desarrollo microbiano. Por ello, la mayoría de diluyentes comprenden azúcares, como la glucosa, galactosa, fructosa, ribosa o trehalosa; sales de NaCI o KCI; bicarbonato, TRIS y/o HEPES. Adicionalmente, pueden contener agentes quelantes, como el EDTA, antibióticos y/o BSA.

Así, los diluyentes convencionales para semen de verraco y conejo son mezclas de productos químicos encaminadas a producir un ambiente en el que los espermatozoides puedan encontrar la energía y las condiciones de presión osmótica, fuerza iónica y pH que les permita mantener su capacidad fecundante durante un determinado lapso de tiempo.

En la siguiente tabla (Tabla 1) se muestra la composición publicada de varios diluyentes clásicos para semen porcino (Gadea J., 2003) .

Tabla 1. Composición (en giL) de varios diluyentes clásicos para semen porcino para un litro de agua destilada.

1

-a: glucosa monohidrato

Asimismo, en la siguiente tabla (Tabla 2) se muestra la composición publicada del diluyente DLBR para semen de conejo (ES2190723) .

Tabla 2. Composición del diluyente OLBR para semen de conejo por litro de agua destilada.

Compuesto Concentración

Tris (hidroximetil) amino metano 0, 250 M

Acido Cítrico 0.0828 M

Glucosa 0, 050 M

EOTA 0, 100 mM

Oihidroestretomicina sulfato 1, 250 mg

Penicilina G sódica 300.000 UI

Penicilina G procaina 700.000 UI

En el mercado existen distintos diluyentes de semen convencionales, entre ellos,

Import-Vet S.A. comercializa dos tipos de diluyente para semen de verraco (NO-4 y NO5) y uno para semen de conejo (NO-C?) . El NO-4 de porcino es un diluyente apto para el mantenimiento del esperma de 3 a 4 días, el NO-5 de porcino lo es para el mantenimiento de 6 a 7 días yel NO-C7 para cunicultura lo es para 1 a 2 días.

La siguiente tabla (Tabla 3) muestra la composición cualitativa de los tres diluyentes comercializados por Import-Vet S.A. (NO-4, NO-5, NO-C?) , donde el símbolo (+) indica la presencia en el diluyente del compuesto en cuestión (Gil Pascual J., resultados no publicados) .

Tabla 3. Composición cualitativa de los diluyentes NO-4, NO-5 y NO-C7.

NO-'t

I~O-5

NO-C7

Glucosa +

+

+

+

ICitrato sódico +

I

+ I I

EOTA

+

+

Bicarbonato sódico +

+

+

Cloruro potásico +

+

+

+

IAcetilcisteina I

+ I I

MOPS

+

+

?93

Presión Osmótica (mOsm)

Cuando se utilizan diluyentes convencionales (sin alginato) , los espermatozoides, con el paso del tiempo, se depositan en el fondo del recipiente utilizado para contener la dosis seminal, ya sea una botella, un tubo termosellado o un blíster. La compactación generada reduce el contacto de los espermatozoides con el diluyente, dificulta el transporte de nutrientes al interior de la célula, altera el metabolismo y favorece la formación de aglutinaciones lo que en su conjunto altera el estado de la membrana espermática y reduce el mantenimiento del poder fecundante de los espermatozoides a lo largo del tiempo.

Cualquier diluyente convencional, entre otros los fabricados por Import-Vet S.A. (ND-4, ND-5, ND-C?) , al que se ha añadido alginato en una concentración entre 0, 25 y 10 gil, objeto de la presente invención, mejora la conservación del esperma y de su poder fecundante. El diluyente de la presente invención tiene una mayor densidad, la cual varía según la concentración de alginato (mayor densidad cuanto más concentración de alginato) . De esta manera, reduce o impide la decantación de los espermatozoides que al mantenerse separados los unos de los otros mantienen el contacto con el diluyente, permitiendo el intercambio metabólico con el medio y reduciendo o impidiendo la formación de aglutinaciones a través del tiempo. Así, las características de la membrana espermática se mantienen durante más tiempo mejorando la capacidad de conservación y de fecundación del esperma. Entre otras características mejoradas por el uso del diluyente de la presente invención se encuentran la motilidad (Figura 2) y la agregación de los... [Seguir leyendo]

1. Diluyente de semen no humano caracterizado por que comprende alginato en una concentración de 0, 25 a 10 gil, Y donde los espermatozoides se encuentran en suspensión.

2. Diluyente según la reivindicación anterior caracterizada por que el alginato es de bario, de calcio o de sodio.

3. Diluyente según la reivindicación anterior caracterizada por que el alginato es alginato sódico.

4. Diluyente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada por que comprende entre 5 y 10 gil de alginato.

5. Diluyente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada por que comprende entre 2, 5 y 4, 90 gil de alginato.

6. Diluyente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada por que comprende entre 1, 25 Y 2, 40 gil de alginato.

7. Diluyente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada por que comprende entre 0, 75 y 1, 24 gil de alginato.

8. Uso del diluyente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para reducir la aglutinación y favorecer la conservación del esperma.

9. Uso del diluyente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de una composición veterinaria para la inseminación artificial de ganado.

10. Uso según la reivindicación 9 para la preparación de una composición veterinaria para inseminación artificial de cerdos y conejos.

11. Uso del diluyente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la segregación de espermatozoides de distinto sexo.

12. Uso del diluyente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de una composición veterinaria para aumentar el porcentaje de progenie con un determinado sexo.

13. Procedimiento para aumentar el porcentaje de espermatozoides hembra o macho caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) obtener semen de un animal no humano macho,

b) dilución del eyaculado a entre 1/2 y 1/10 eyaculado/diluyente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,

e) llenar con dicho semen diluido bolsas de plástico con forma de tubo de 35 a 45

mm de ancho y de 350 a 450 mm de largo,

d) dejar la bolsa en reposo, en posición vertical, de 10 a 20 horas, a una

temperatura entre 19 y 25°C, para que se separen los espermatozoides en

5 distintos estratos,

e) pinzar las bolsas separando los distintos estratos superior, medio e inferior,

f) obtener espermatozoides del estrato superior para aumentar el número de crías

hembra y del estrato inferior para aumentar el número de crías macho.

FIGURA 1

100 90 80 70

"'CI 60

ro "'CI

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o 50

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"*

20 10

O O 2 3 6 7

Días de conservación

FIGURA 2

2, 5

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Días de conservación FIGURA 3

96 94

:D 92

ro E 90

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ro E 86

o V'l

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'*' 82 80 78 76

- +-ND-5 _PD

o 2 3 Días de conservación FIGURA 4

10. 20 h

FIGURA 5