Método de obtención de datos útiles para evaluar la respuesta al tratamiento con 5-fluorouracilo (5-FU).

Método in vitro de obtención de datos útiles para evaluar la respuesta al tratamiento con 5-fluorouracilo (5-FU).

La invención describe un Método in vitro de obtención de datos útiles para evaluar la respuesta al tratamiento con 5-fluorouracilo (5-FU) sólo o en combinación con otros principios activos como el IFN alpha de pacientes con cáncer de colon y mama.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201130247.

Solicitante: SERVICIO ANDALUZ DE SALUD.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: ESTEBAN RODRIGUEZ,MARIANO, ARANEGA JIMENEZ,ANTONIA, MARCHAL CORRALES,JUAN ANTONIO, GARCÍA CHAVES,María Ángel, AGUILERA GÓMEZ,Margarita, CALLEJA HERNÁNDEZ,Miguel Ángel, CARRASCO PARDO,Esther, JIMÉNEZ GONZÁLEZ,Gema.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/48 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una transferasa.
  • C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2393984_A1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método de obtención de datos útiles para evaluar la respuesta al tratamiento con 5-fluorouracilo (5-FU) .

La presente invención se encuentra dentro de la medicina y la biología molecular, y se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para evaluar la respuesta al tratamiento con 5-fluorouracilo (5-FU) , en particular en pacientes con cáncer de colon y mama, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali-y cuantitativo) específico, estableciendo distintos grupos de pacientes.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La proteína celular inducida por Interferón PKR, es una quinasa que tiene un papel fundamental en la actividad antitumoral y antiviral que desempeña el Interferón tipo I.

El activador de PKR mejor caracterizado es el ARN de doble cadena que se produce durante la infección de diversos virus, pero también se activa por distintos tipos de estrés celular como polioles como la heparina, y otros compuestos como el etanol, el arsénico, ceramida, ect.., Su mecanismo de acción fundamental es producir la parada en la síntesis de proteínas de la célula y activar el factor de transcripción NFkB que permite que la célula siga viviendo si el problema que causó su activación se resuelve. Si el estrés celular continua, PKR finalmente provoca la muerte de la célula de forma controlada por apoptosis. PKR, por tanto, puede actuar como supresor de tumores y recientemente se ha demostrado que es fundamental para la actividad supresora de tumores de la conocida proteína p53. Uno de los mecanismos principales a través del cual, el 5-FU ejerce su actividad antitumoral es a través de inducción de apoptosis. La proteína implicada en este fenómeno es el supresor de tumores p53. Pero se sabe que más del 50% de los tumores tiene mutaciones en p53, y que células tumorales con p53 inactivo pueden morir por apoptosis en respuesta al quimioterapéutico 5-FU. Por tanto se desconoce cómo 5FU induce la muerte de las células tumorales en ausencia de p53. Nosotros hemos descubierto que es precisamente a través de la activación de la proteína PKR como se lleva a cabo este proceso. PKR se activa en respuesta a 5-FU aun en ausencia de p53, induciendo la parada en la síntesis de proteínas celulares y finalmente induciendo muerte celular por apoptosis.

Por tanto, p53 junto con PKR son marcadores celulares claves en el efecto de muerte de células tumorales por apoptosis que provoca la terapia basada en el uso del 5-FU.

Son varios lo compuestos que han sido combinados con 5-FU para aumentar su eficacia, como el oxaliplatino y el irinotecan. Además numerosos ensayos clínicos están demostrando que el uso combinado de drogas con citoquinas naturales, están aumentando la eficacia antitumoral de los quimioterapeúticos usados en clínica. Concretamente, el IFN alpha ha demostrado mejorar la eficacia del 5-FU tanto en ensayos in vitro como en ensayos clínicos con pacientes. Aunque el mecanismo de este aumento de eficacia aun no se conoce del todo, y por tanto no se sabe por qué hay pacientes que no responden a esta combinación, nosotros proponemos, que el aumento que el IFNalpha ejerce sobre PKR puede ser uno de los fenómenos implicados en dicha efectividad.

Por tanto, conocer si PKR y p53 están mutados en los tumores, puede ser de gran utilidad para el pronóstico de respuesta a terapias basadas en el uso de 5-FU y su combinación con otras drogas o citoquinas como el IFN.

Se conoce que hay un porcentaje muy considerable de pacientes que no responden a la quimioterapia basada en el uso del 5-FU. Dado el papel que desempeña p53 en la muerte inducida por 5-FU, numerosos trabajos han intentado demostrar que la ausencia de respuesta se debe a mutaciones en dicho supresor de tumores. Desgraciadamente, la mayoría de los trabajos no han conseguido demostrar esa relación, concluyendo que deben de existir más marcadores celulares implicados en la respuesta a la quimioterapia. Las terapias alternativas comentadas anteriormente, como la combinación de IFNalpha y 5-FU, han sido útiles en algunos carcinomas, Sin embargo, dichas terapias tienen efectos secundarios agresivos como la aparición de fiebre, escalofríos, dolores y molestias generalizadas, dolor de cabeza (cefalea) , poco apetito, disminución temporal de los niveles de glóbulos blancos y rojos y de plaquetas, lo que aumenta el riesgo de padecer una infección, anemia y/o hemorragias, etc.

Es necesario, por tanto, encontrar un método de de obtención de datos útiles para evaluar la respuesta al tratamiento con 5-fluorouracilo y sus combinaciones, que minimice la iatrogenia del empleo de terapias combinadas de fármacos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han identificado a PKR como un nuevo marcador de evaluación de respuesta al tratamiento del cáncer con 5-FU. Los resultados de los estudios en líneas celulares y muestras de pacientes con cáncer, muestran mutaciones en la secuencia genética de la proteína PKR, y alteraciones en la actividad de esta proteína, lo que puede ser utilizado como marcador de la respuesta a 5-FU.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de la proteína PKR (o del gen pkr que la codifica) para la obtención de datos útiles de la respuesta al tratamiento con 5-fluorouracilo, o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos. El tratamiento con 5-FU puede ser sólo, o en combinación con otros fármacos, preferentemente con IFN alpha.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles de la respuesta al tratamiento con 5-fluorouracilo, o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos, de ahora en adelante método de la invención, que comprende:

a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b) determinar la actividad de la proteína PKR, en la muestra biológica aislada de (a) , o la secuencia de la proteína PKR o del gen pkr que la codifica.

El tratamiento con 5-FU puede ser sólo, o en combinación con otros fármacos, preferentemente con IFN alpha. En una realización preferida de la invención, la actividad de la proteína PKR se determina mediante la detección de la cantidad de expresión del gen pkr.

En otra realización preferida, la actividad de la proteína PKR se determina mediante la secuencia del gen de PKR. En otra realización preferida, se detectan las mutaciones de la secuencia que codifica para PKR. Mutaciones en dicha secuencia pueden ser indicativas de una distinta actividad.

En otra realización preferida, la actividad de la proteína PKR se determina mediante la detección de la cantidad de proteína PKR, y más preferiblemente, mediante la cantidad de proteína PKR fosforilada.

Más preferiblemente, la muestra biológica del individuo del paso (a) son células tumorales.

En otra realización preferida, el método de la invención además comprende:

c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia, o con una secuencia de referencia.

Si la cantidad o actividad de la proteína PKR, o la expresión del gen pkr no es la suficiente, o el gen presenta determinados polimorfismos, entonces se puede determinar que el paciente no es respondedor al tratamiento con 5-FU.

Los pasos (b) y/o (c) del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la determinación de la actividad de PKR o la detección de los niveles de expresión de pkr, o de la identificación de varios polimorfismos en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c) .

La determinación de la actividad de la proteína PKR, mediante por ejemplo, la detección de la cantidad de expresión del gen pkr, o de determinados polimorfismos en la secuencia del gen, permite discriminar entre individuos respondedores e individuos no respondedores, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98%... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. El uso de la proteína PKR o del gen pkr que la codifica, para la obtención de datos útiles de la respuesta al tratamiento con 5fluorouracilo, o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos.

2. El uso de la proteína PKR o del gen pkr que la codifica, donde el tratamiento con 5-FU es un tratamiento combinado con IFN alpha.

3. Un método de obtención de datos útiles para determinar la respuesta al tratamiento con 5-fluorouracilo, o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b) determinar la actividad de la proteína PKR, en la muestra biológica aislada de (a) , o la secuencia de la proteína PKR o del gen pkr que la codifica.

4. El método según la reivindicación 3, donde la muestra biológica del individuo del paso (a) son células tumorales.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, donde la actividad de la proteína PKR se determina mediante la detección de la cantidad de expresión del gen pkr.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, donde la actividad de la proteína PKR se determina mediante la detección de la cantidad de proteína PKR.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, donde la detección de la cantidad de expresión del gen pkr se realiza mediante PCR.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, donde la detección de mutaciones y polimorfismos de la proteína PKR se determina mediante secuenciación de ADN.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 6, donde la detección de la actividad de PKR se determina mediante un inmunoensayo.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, que además comprende: c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia o con una secuencia de referencia.

11. Un kit o dispositivo que comprende cualquiera de los cebadores recogidos en las secuencias SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 10 para analizar la actividad de PKR, o secuenciar el gen pkr.

12. El kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende cualquiera de los cebadores recogidos en las secuencias SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 10 para analizar la cantidad de productos de expresión del gen pkr .

13. Cebador de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 3.

14. Cebador de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 4.

15. Cebador de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 5.

16. Cebador de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 6.

17. Cebador de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 7.

18. Cebador de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 8. 19- Cebador de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 9. 20- Cebador de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 10. 21- El uso del kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 11

12, para la obtención de datos útiles de la respuesta al tratamiento con

5. Fluorouracilo.

A

Fig. 1

B

Fig. 1

A

Fig. 2

B

Fig. 2

Fig. 2

D

Fig. 2

A

B

Fig. 3

Fig. 3

A

B

Fig. 4

Fig. 4

A

Fig. 5

B

Fig. 5

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Servicio Andaluz de Salud

<110> Universidad de Granada

<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)

<120> Método de obtención de datos útiles para evaluar la respuesta altratamiento con 5-fluorouracilo (5-FU) .

<130> P-04309

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 551

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Gly Asp Leu Ser Ala Gly Phe Phe Met Glu Glu Leu Asn Thr1 5 1015

Tyr Arg Gln Lys Gln Gly Val Val Leu Lys Tyr Gln Glu Leu Pro Asn20 25 30

Ser Gly Pro Pro His Asp Arg Arg Phe Thr Phe Gln Val Ile Ile Asp35 40 45

Gly Arg Glu Phe Pro Glu Gly Glu Gly Arg Ser Lys Lys Glu Ala Lys50 55 60

Asn Ala Ala Ala Lys Leu Ala Val Glu Ile Leu Asn Lys Glu Lys Lys65 70 75 80

Ala Val Ser Pro Leu Leu Leu Thr Thr Thr Asn Ser Ser Glu Gly Leu85 90 95

Ser Met Gly Asn Tyr Ile Gly Leu Ile Asn Arg Ile Ala Gln Lys Lys100 105 110

Arg Leu Thr Val Asn Tyr Glu Gln Cys Ala Ser Gly Val His Gly Pro115 120 125

Glu Gly Phe His Tyr Lys Cys Lys Met Gly Gln Lys Glu Tyr Ser Ile130 135 140

Gly Thr Gly Ser Thr Lys Gln Glu Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Leu145 150 155 160

Ala Tyr Leu Gln Ile Leu Ser Glu Glu Thr Ser Val Lys Ser Asp Tyr165 170 175

Leu Ser Ser Gly Ser Phe Ala Thr Thr Cys Glu Ser Gln Ser Asn Ser180 185 190

Leu Val Thr Ser Thr Leu Ala Ser Glu Ser Ser Ser Glu Gly Asp Phe195 200 205

Ser Ala Asp Thr Ser Glu Ile Asn Ser Asn Ser Asp Ser Leu Asn Ser210 215 220

Ser Ser Leu Leu Met Asn Gly Leu Arg Asn Asn Gln Arg Lys Ala Lys225 230 235 240

Arg Ser Leu Ala Pro Arg Phe Asp Leu Pro Asp Met Lys Glu Thr Lys245 250 255

Tyr Thr Val Asp Lys Arg Phe Gly Met Asp Phe Lys Glu Ile Glu Leu260 265 270

Ile Gly Ser Gly Gly Phe Gly Gln Val Phe Lys Ala Lys His Arg Ile275 280 285

Asp Gly Lys Thr Tyr Val Ile Lys Arg Val Lys Tyr Asn Asn Glu Lys290 295 300

Ala Glu Arg Glu Val Lys Ala Leu Ala Lys Leu Asp His Val Asn Ile305 310 315 320

Val His Tyr Asn Gly Cys Trp Asp Gly Phe Asp Tyr Asp Pro Glu Thr325 330 335

Ser Asp Asp Ser Leu Glu Ser Ser Asp Tyr Asp Pro Glu Asn Ser Lys340 345 350

Asn Ser Ser Arg Ser Lys Thr Lys Cys Leu Phe Ile Gln Met Glu Phe355 360 365

Cys Asp Lys Gly Thr Leu Glu Gln Trp Ile Glu Lys Arg Arg Gly Glu370 375 380

Lys Leu Asp Lys Val Leu Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Ile Thr Lys385 390 395 400

Gly Val Asp Tyr Ile His Ser Lys Lys Leu Ile His Arg Asp Leu Lys405 410 415

Pro Ser Asn Ile Phe Leu Val Asp Thr Lys Gln Val Lys Ile Gly Asp420 425 430

Phe Gly Leu Val Thr Ser Leu Lys Asn Asp Gly Lys Arg Thr Arg Ser435 440 445

Lys Gly Thr Leu Arg Tyr Met Ser Pro Glu Gln Ile Ser Ser Gln Asp450 455 460

Tyr Gly Lys Glu Val Asp Leu Tyr Ala Leu Gly Leu Ile Leu Ala Glu465 470 475 480

Leu Leu His Val Cys Asp Thr Ala Phe Glu Thr Ser Lys Phe Phe Thr485 490 495

Asp Leu Arg Asp Gly Ile Ile Ser Asp Ile Phe Asp Lys Lys Glu Lys500 505 510

Thr Leu Leu Gln Lys Leu Leu Ser Lys Lys Pro Glu Asp Arg Pro Asn515 520 525

Thr Ser Glu Ile Leu Arg Thr Leu Thr Val Trp Lys Lys Ser Pro Glu530 535 540

Lys Asn Glu Arg His Thr Cys545 550

<210> 2

<211> 2930

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2 agcagacgag ggcttgtgcg agagggggcc gggcggctgc agggaaggcg gagtccaagg 60

ggaaaacgaa actgagaacc agctctcccg aagccgcggg tctccggccg gcggcggcgg 120

cggcggcggc ggcggcgcag tttgctcata ctttgtgact tgcggtcaca gtggcattca 180

gctccacact tggtagaacc acaggcacga caagcataga aacatcctaa acaatcttca 240

tcgaggcatc gaggtccatc ccaataaaaa tcaggagacc ctggctatca tagaccttag 300

tcttcgctgg tatcactcgt ctgtctgaac cagcggttgc atttttttaa gccttctttt 360

ttctctttta ccagtttctg gagcaaattc agtttgcctt cctggatttg taaattgtaa 420

tgacctcaaa actttagcag ttcttccatc tgactcaggt ttgcttctct ggcggtcttc 480 agaatcaaca tccacacttc cgtgattatc tgcgtgcatt ttggacaaag cttccaacca 540 ggatacggga agaagaaatg gctggtgatc tttcagcagg tttcttcatg gaggaactta 600 atacataccg tcagaagcag ggagtagtac ttaaatatca agaactgcct aattcaggac 660 ctccacatga taggaggttt acatttcaag ttataataga tggaagagaa tttccagaag 720 gtgaaggtag atcaaagaag gaagcaaaaa atgccgcagc caaattagct gttgagatac 780 ttaataagga aaagaaggca gttagtcctt tattattgac aacaacgaat tcttcagaag 840 gattatccat ggggaattac ataggcctta tcaatagaat tgcccagaag aaaagactaa 900 ctgtaaatta tgaacagtgt gcatcggggg tgcatgggcc agaaggattt cattataaat 960 gcaaaatggg acagaaagaa tatagtattg gtacaggttc tactaaacag gaagcaaaac 1020 aattggccgc taaacttgca tatcttcaga tattatcaga agaaacctca gtgaaatctg 1080 actacctgtc ctctggttct tttgctacta cgtgtgagtc ccaaagcaac tctttagtga 1140 ccagcacact cgcttctgaa tcatcatctg aaggtgactt ctcagcagat acatcagaga 1200 taaattctaa cagtgacagt ttaaacagtt cttcgttgct tatgaatggt ctcagaaata 1260 atcaaaggaa ggcaaaaaga tctttggcac ccagatttga ccttcctgac atgaaagaaa 1320 caaagtatac tgtggacaag aggtttggca tggattttaa agaaatagaa ttaattggct 1380 caggtggatt tggccaagtt ttcaaagcaa aacacagaat tgacggaaag acttacgtta 1440 ttaaacgtgt taaatataat aacgagaagg cggagcgtga agtaaaagca ttggcaaaac 1500 ttgatcatgt aaatattgtt cactacaatg gctgttggga tggatttgat tatgatcctg 1560 agaccagtga tgattctctt gagagcagtg attatgatcc tgagaacagc aaaaatagtt 1620 caaggtcaaa gactaagtgc cttttcatcc aaatggaatt ctgtgataaa gggaccttgg 1680 aacaatggat tgaaaaaaga agaggcgaga aactagacaa agttttggct ttggaactct 1740 ttgaacaaat aacaaaaggg gtggattata tacattcaaa aaaattaatt catagagatc 1800 ttaagccaag taatatattc ttagtagata caaaacaagt aaagattgga gactttggac 1860 ttgtaacatc tctgaaaaat gatggaaagc gaacaaggag taagggaact ttgcgataca 1920 tgagcccaga acagatttct tcgcaagact atggaaagga agtggacctc tacgctttgg 1980 ggctaattct tgctgaactt cttcatgtat gtgacactgc ttttgaaaca tcaaagtttt 2040 tcacagacct acgggatggc atcatctcag atatatttga taaaaaagaa aaaactcttc 2100 tacagaaatt actctcaaag aaacctgagg atcgacctaa cacatctgaa atactaagga 2160 ccttgactgt gtggaagaaa agcccagaga aaaatgaacg acacacatgt tagagccctt 2220 ctgaaaaagt atcctgcttc tgatatgcag ttttccttaa attatctaaa atctgctagg 2280

gaatatcaat agatatttac cttttatttt aatgtttcct ttaatttttt actattttta 2340 ctaatctttc tgcagaaaca gaaaggtttt cttctttttg cttcaaaaac attcttacat 2400 tttacttttt cctggctcat ctctttattc tttttttttt tttaaagaca gagtctcgct 2460 ctgttgccca ggctggagtg caatgacaca gtcttggctc actgcaactt ctgcctcttg 2520 ggttcaagtg attctcctgc ctcagcctcc tgagtagctg gattacaggc atgtgccacc 2580 cacccaacta atttttgtgt ttttaataaa gacagggttt caccatgttg gccaggctgg 2640 tctcaaactc ctgacctcaa gtaatccacc tgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac 2700 agggatgagc caccgcgccc agcctcatct ctttgttcta aagatggaaa aaccaccccc 2760 aaattttctt tttatactat taatgaatca atcaattcat atctatttat taaatttcta 2820 ccgcttttag gccaaaaaaa tgtaagatcg ttctctgcct cacatagctt acaagccagc 2880 tggagaaata tggtactcat taaaaaaaaa aaaaaaagtg atgtacaacc 2930

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador PKR Carboxi-terminal (F)

<400> 3 gaaggcggag cgtgaagtaa aagc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador PKR Carboxi-terminal (R)

<400> 4 cttccacaca gtcaaggtcc ttag 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador PKR Dominio regulador (F)

<400> 5 gacctccaca tgataggagg 20

<210> 6

<211> 21

<212> <213> DNA Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador PKR Dominio regulador (R)

<400> 6 ccatggataa tccttctgaa g 21

<210> <211> <212> <213> 7 24 DNA Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador PKR Dominio kinasa (F)

<400> 7 gaaggcggag cgtgaagtaa aagc 24

<210> <211> <212> <213> 8 20 DNA Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador PKR Dominio kinasa (R)

<400> 8 ggatcataat cactgctctc 20

<210> <211> <212> <213> 9 20 DNA Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador PKR Dominio catalítico (F)

<400> 9 cttcttcatg tatgtgacac 20

<210> <211> <212> <213> 10 24 DNA Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador PKR Dominio catalítico (R)

<400> 10 cttccacaca gtcaaggtcc ttag 24


 

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