Método de ensayo de una sustancia capaz de cambiar el potencial de membrana mitocondrial.

Un método de ensayo de una sustancia, que comprende las siguientes etapas de:

(a) poner en contacto una célula cultivada de una línea celular humana con una sustancia de ensayo,

(b) poner en contacto la célula cultivada con ouabaína a una concentración de iones de potasio 20-90 mM,

(c) medir el cambio en el potencial de membrana mitocondrial de la célula cultivada, y

(d) seleccionar una sustancia que cambia el potencial de membrana mitocondrial de la célula cultivada.

Método de ensayo de una sustancia capaz de cambiar el potencial de membrana mitocondrial

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método de ensayo de una sustancia capaz de cambiar el potencial de membrana mitocondrial. Alternativamente, se refiere a un método de ensayo de una sustancia que inhibe la entrada de calcio en las mitocondrias. Más concretamente, la presente invención se refiere a un método de ensayo de un abridor del canal de K+ sensible a ATP (canal de K+ sensible a ATP mitocondrial, denominado en lo sucesivo canal mito KATP) en la membrana mitocondrial interna.

Técnica anterior

Se sabe que el canal de K+ sensible a ATP de la membrana celular (denominado en lo sucesivo, canal sarcKATP) está presente en la membrana celular del miocardio, la membrana celular del músculo liso y la membrana de las células β pancreáticas, y regula la concentración de calcio en el citoplasma (véase la referencia no de patente 1) . Convencionalmente, los abridores del canal KATP en la membrana celular del miocardio y de la membrana celular del músculo liso se han estudiado como fármacos terapéuticos para la angina de pecho y la hipertensión. El bloqueador del canal KATP de la membrana celular β-pancreática se ha comercializado como un fármaco terapéutico para la diabetes.

En los últimos años, se ha sido farmacológicamente y fisiológicamente que el canal mitoKATP está presente y se puede prevenir la lesión isquémica de las células mediante la apertura del canal (véase la referencia no de patente 2) .

Durante la isquemia, en la célula, la actividad Na/K ATPasa en la membrana celular disminuye debido al cese de la producción de energía, y aumenta la concentración intracelular de Na. Tras la reperfusión del flujo sanguíneo, el Na intracelular que aumenta durante la isquemia es intercambiado por Ca extracelular para aumentar el Ca intracelular. El influjo de Ca en la mitocondria aumenta la concentración de Ca intramitocondrial y despolariza la membrana mitocondrial interna. Por otra parte, las especies reactivas del oxígeno producidas por reperfusión también promueven la despolarización de la membrana mitocondrial interna.

Cuando el canal mitoKATP se abre previamente, se puede inhibir el influjo de Ca a la mitocondria durante la reperfusión, y también se inhibe la despolarización de la membrana mitocondrial interna (véase la referencia no de patente 3) .

Para el estudio de la relación entre la acción de apertura del canal mitoKATP y la patología, se conocen generalmente

(1) un método de ensayo que utiliza una línea celular tal como células Girardi, células PC12, células SHSY-5Y, celulas de neuroblastoma humano, células de músculo cardiaco de rata cultivadas primarias y similares, (2) un método de ensayo que utiliza mitocondrias aisladas de una célula mediante centrifugación, (3) un método basado en el ensayo del efecto sobre el corazón aislado y similares.

Además, se ha informado sobre el siguiente método de ensayo utilizando células Girardi (GIRARDI HEART: ECACC Núm. 9312082) .

(1) Se sembraron células Girardi en una placa de cultivo de 24 pocillos, se añadieron adenosina o diazóxido (abridor del canal de mitoKATP) , las células se cultivaron durante 3 horas en un medio de cultivo acidulado que contenía un inhibidor del metabolismo y similares, en condiciones de bajo contenido de oxígeno para reproducir un estado de isquemia, y se cultivaron adicionalmente durante 1 hora en un medio de cultivo normal a una concentración de oxígeno normal. Por lo tanto, para evaluar el nivel de la apoptosis, se añadió un indicador de muerte celular PI (yoduro de propidio) , y las células se trataron con tripsina y EDTA para ponerlas en flotación. Se midió la fluorescencia a 565-640 nm emitida por las células muertas que habían incorporado PI por citometría de flujo, y se determinó la distribución del número de células. Además, sin el tratamiento de las células con PI y tripsina, se midió la concentración de ácido láctico deshidrogenasa en el sobrenadante del cultivo. Como resultado, la adenosina inhibió fuertemente la apoptosis, y quedó claro que el efecto derivaba de la acción de apertura del canal de mitoKATP a través de la activación del sistema de la p38MAP quinasa (véase la referencia no de patente 4) .

Alternativamente, (2) se sembraron células Girardi sobre una placa de cultivo de 6 o 24 pocillos, se cultivaron durante un tiempo dado en un medio de cultivo que contenía colorante sensible al potencial de membrana mitocondrial JC-1, y a continuación en un medio de cultivo que contenía agente de despolarización mitocondrial CCCP, y se examinó el cambio en la intensidad de fluorescencia de color rojo, que es un índice del potencial de membrana mitocondrial, mediante citometría de flujo. Como resultado, se observaron una disminución de la intensidad de fluorescencia y una despolarización de la mitocondria (véase la referencia no de patente 5) .

Varias otras publicaciones (documentos WO 00/19200 A; WO 00/79274 A; WO 00/68686 A; Ishida, H. et al., Naunyn Schmiedebergs Arch, Pharmacol. (2004) vol. 369, Núm. 2, págs. 192-197; Sato T. et al., The Journal of

Pharmacology and Experimental Therapeutics (2003) vol. 307, Núm. 3, págs. 955-960) describen el uso de colorantes fluorescentes para medir los cambios en el potencial de membrana mitocondrial.

Mientras tanto, existe un informe que confirma la acción de apertura del canal de mitoKATP del diazóxido en células de músculo cardiaco neonatal de rata cultivadas primarias, utilizando las propiedades de ouabaína, un inhibidor de la Na/K ATPasa de la membrana celular, para aumentar la concentración intracelular de Ca y la concentración intramitocondrial de Ca (véase la referencia no de patente 6) .

Sin embargo, los métodos convencionales se asocian con aspectos que todavía tienen que mejorar.

Para ser más específicos, en los métodos mencionados anteriormente, (1) durante el cultivo en condiciones de bajo oxígeno, el entorno de cultivo es difícil de mantener a un nivel constante y los niveles de lesión varían fácilmente entre los pocillos; (2) es necesario preparar células en gran cantidades puesto que la lesión celular se determina por citometría de flujo o medición de la concentración de ácido láctico deshidrogenasa; (3) en la citometría de flujo, la operación hasta la detección de fluorescencia es complicada, y (4) en la medición de la concentración de ácido láctico deshidrogenasa, la medición de la absorbancia es complicada.

Por otra parte, se ha informado de un método de escrutinio de un compuesto influyente en el potencial de oxidaciónreducción de la mitocondria, que se basa en la medición del cambio de fluorescencia, (referencia de patente 1) . Sin embargo, incluso mediante el método descrito en la patente de referencia 1, el ensayo de una muestra requiere una operación complicada y una cantidad considerable de tiempo de funcionamiento.

Como se describió anteriormente, puesto que los métodos convencionales tienen dificultades para reproducir condiciones constantes, y puesto que el tiempo y el trabajo necesarios para el ensayo son enormes, los métodos no son adecuados para un ensayo simultáneo de un gran número de agentes farmacéuticos.

referencia de patente 1: WO99/53024

referencia no de patente 1: Kidney Int. 57, 838, 2000

referencia no de patente 2: Circ Res. 84, 973, 1999

referencia no de patente 3: Cardiovasc. Res. 55, 534, 2002

referencia no de patente 4: Basic Res. Cardiol. 95, 243, 2000

referencia de no patente 5: Cardiavasc. Res. 51, 691, 2001

referencia no de patente 6: Circ. Res. 89, 856, 2001

Descripción de la invención Problemas a resolver por la invención La presente invención tiene como objetivo proporcionar un método de ensayo conveniente y de alta precisión de un agente farmacéutico que cambia el potencial de membrana mitocondrial, utilizando el potencial de membrana mitocondrial de una célula cultivada como un índice.

Medios para resolver los problemas Los autores de la presente invención cultivaron células Girardi, tiñeron las mitocondrias con colorante sensible al potencial de membrana mitocondrial JC-1, determinaron la proporción de la intensidad de fluorescencia del monómero de JC-1 y la fluorescencia del agregado J (monómero/agregado J) , desarrollada por la luz de excitación, por medio de un lector de placas de fluorescencia, y midieron el potencial de la membrana mitocondrial con la proporción de la intensidad de fluorescencia como índice. Como resultado, han encontrado que una adición simultánea de KCl a ouabaína da como resultado una... [Seguir leyendo]

1. Un método de ensayo de una sustancia, que comprende las siguientes etapas de:

(a) poner en contacto una célula cultivada de una línea celular humana con una sustancia de ensayo,

(b) poner en contacto la célula cultivada con ouabaína a una concentración de iones de potasi.

2. 90 mM, 5 (c) medir el cambio en el potencial de membrana mitocondrial de la célula cultivada, y

(d) seleccionar una sustancia que cambia el potencial de membrana mitocondrial de la célula cultivada.

2. El método de ensayo de la reivindicación 1, en donde la sustancia del apartado (d) inhibe la apoptosis de las células.

3. El método de ensayo de la reivindicación 1, en donde la sustancia del apartado (d) inhibe el influjo de calcio a las 10 mitocondrias.

4. El método de ensayo de la reivindicación 1, en donde la sustancia del apartado (d) actúa sobre el canal de K+ sensible a ATP mitocondrial.

5. El método de ensayo de la reivindicación 1, en donde la célula cultivada deriva de corazón, cerebro, nervio, hígado o páncreas humanos.

6. El método de ensayo de la reivindicación 1, en donde la célula cultivada es una célula Girardi.

7. El método de ensayo de la reivindicación 1, en donde la ouabaína tiene una concentración de 0, 1 μM - 3 mM.