Método de detección y/o de medición de hepcidina en una muestra.

Un método de determinación de una concentración de hepcidina en una muestra que comprende (1) separar lahepcidina de la muestra antes de someter la hepcidina a espectrometría de masas usando extracción en fase sólida;

(2)someter la hepcidina y un patrón interno a espectrometría de masas en tándem para producir un espectro de masas quetiene una señal de hepcidina y una señal del patrón interno; (3) medir una intensidad de la señal de hepcidina y la señaldel patrón interno; y (4) correlacionar la intensidad de la señal de hepcidina y la intensidad de la señal del patrón internocon una curva patrón de concentraciones de hepcidina para determinar la concentración de hepcidina en la muestra, enel que el patrón interno comprende SEC ID Nº 4 isotópicamente marcada.

Método de detección y/o de medición de hepcidina en una muestra La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/832.625 presentada el 21 de julio de 2006.

Campo de la invención Los métodos desvelados en el presente documento se refieren al aislamiento de hepcidina, detección de hepcidina y a mediciones de niveles de hepcidina en muestras biológicas. En particular, los métodos desvelados en el presente documento permiten el eficaz aislamiento de hepcidina de una muestra y la medición cuantitativa de niveles de hepcidina en la muestra.

Antecedentes de la invención El hierro es un oligoelemento esencial requerido para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos vivos. Por ejemplo, el hierro es indispensable para la síntesis de ADN y en una amplia variedad de procesos metabólicos. Las alteraciones del metabolismo del hierro participan en varias enfermedades de mamífero significativas que incluyen, pero no se limitan a, anemia por deficiencia de hiero, hemosiderosis, y la enfermedad de sobrecarga de hierro hemocromatosis (Andrews, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 1:75 (2000) ; Philpott, Hepatology 35:993 (2002) ; Beutler y col., Drug-Metab. Dispos. 29:495 (2001) ) .

El contenido de hierro en mamíferos se regula controlando la absorción, predominantemente en el duodeno y el yeyuno superior, que es el único mecanismo por el que las reservas de hierro son fisiológicamente controladas (Philpott, Hepatology 35:993 (2002) ) . Tras la absorción, el hierro se une a transferrina circulante y se libera a los tejidos en todo el cuerpo. El hígado es el principal sitio de almacenamiento de hierro.

Existe un mecanismo de retroalimentación que potencia la absorción de hierro en individuos que son deficientes en hierro, y que reduce la absorción de hierro en individuos con sobrecarga de hierro (Andrews Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 1:75 (2000) ; Philpott, Hepatology 35:993 (2002) ; Beutler y col., Drug-Metab. Dispos. 29:495 (2001) ) . El mecanismo molecular por el que el intestino responde a alteraciones en los requisitos de hierro corporal solo se ha aclarado recientemente. En este contexto, se ha mostrado que la hepcidina, un polipéptido de mamífero recientemente identificado (Krause y col., FEBS Lett. 480:147 (2000) ; Park y col., J. Biol. Chem. 276:7806 (2001) ) es un componente de señalización clave que regula la homeostasis del hierro (Philpott, Hepatology 35:993 (2002) ; Nicolas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:4396 (2002) ) . La hepcidina se aisló como un polipéptido de 25 aminoácido (aa) en plasma y orina humanos, presentando actividad antimicrobiana (Krause y col., FEBS Lett. 480:147 (2000) ; Park y col., J. Biol. Chem. 276:7806 (2001) ) . Un ADNc de hepcidina que codifica un precursor de 83 aa en ratones y un precursor de 84 aa en rata y ser humano, que incluye un péptido señal de 24 aa putativo, se identificó posteriormente buscando genes específicos para hígado que se regularon por hierro (Pigeon y col., J. Biol. Chem. 276:7811 (2001) ) .

La asociación de hepcidina con respuesta inmunitaria innata se deriva de la observación de una robusta regulación por incremento de la expresión génica de hepcidina después de estímulos inflamatorios, tales como infecciones, que inducen la respuesta de fase aguda de los sistemas inmunitarios innatos de vertebrados. En ratones se mostró que la expresión 45 génica de hepcidina se regulaba por incremento por lipopolisacárido (LPS) , turpentina, adyuvante completo de Freund e infecciones adenovirales.

Los estudios realizados con hepatocitos primarios humanos indicaron que la expresión génica de hepcidina respondió a la adición de interleucina-6 (IL-6) , pero no a interleucina-1α (IL-1a) o factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) . De acuerdo con esta observación, la infusión de voluntarios humanos con IL-6 provocó el rápido aumento de niveles del péptido hepcidina bioactivo en suero y orina, y se igualó por una disminución en la saturación de hierro y transferrina en suero. También se encontró una fuerte correlación entre expresión de hepcidina y anemia de inflamación en pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas, que incluyen infecciones bacterianas, fúngicas y virales. Estos hallazgos, en asociación con datos murinos similares, condujeron a la conclusión de que la inducción de hepcidina durante la 55 inflamación depende de IL-6, y que el eje de hepcidina-IL-6 es responsable de la respuesta hipoferrémica y posterior restricción de hierro de patógenos transmitidos por la sangre.

La función principal de la hepcidina y sus funciones claves en la regulación del hierro y en la respuesta inmunitaria innata para infección ilustra la necesidad de métodos y herramientas de diagnóstico informativas para la medición de formas bioactivas maduras de hepcidina en muestras biológicas y para la regulación de la producción de hepcidina.

Purificando parcialmente la hepcidina de muestras de orina se demostró que la secreción de hepcidina en orina se eleva entre 10 y 100 veces con respecto a niveles normales en condiciones de inflamación (Park y col., J. Biol. Chem. 276 (11) :7806 (2001) ) . En estudios de ratón, el único método de detección de la regulación por incremento de hepcidina 65 se basó en el análisis de ARN, que puede no correlacionarse con niveles de hepcidina circulante. Hasta la fecha no está disponible ningún método para medir con exactitud los niveles de hepcidina en suero o plasma. El método urinario descrito anteriormente no aclara los niveles de hepcidina circulante absolutos. Otros ensayos desarrollados para medir niveles en suero son o bien semicuantitativos (Tomosugi y col., Blood, previo a la publicación de abril de 2006) o solo pueden detectar pro-hepcidina, una especie que no se correlaciona con la inducción de hepcidina (Kemna y col., Blood 106:1864-1866 (2005) ) . Un ensayo que permite la precisa cuantificación de niveles de hepcidina es crítico para identificar

pacientes que pueden beneficiarse de una estrategia de bloqueo de hepcidina para tratar la anemia de inflamación u otros trastornos relacionados.

Sumario de la invención En el presente documento se desvelan métodos de aislamiento y/o determinación de la concentración de hepcidina en una muestra. En particular, se desvelan un método para cuantificar hepcidina en una muestra biológica usando espectrometría de masas y un método de purificación y/o separación de hepcidina de una muestra biológica.

Por tanto, un aspecto de la invención es proporcionar un método de determinación de una concentración de hepcidina en una muestra que comprende (1) separar la hepcidina de la muestra antes de someter la hepcidina a espectrometría de masas usando extracción en fase sólida; (2) someter la hepcidina y un patrón interno a espectrometría de masas en tándem para producir un espectro de masas que tiene una señal de hepcidina y una señal del patrón interno; (3) medir una intensidad de la señal de hepcidina y la señal del patrón interno; y (4) correlacionar la intensidad de la señal de hepcidina y la intensidad de la señal del patrón interno a una curva patrón de concentraciones de hepcidina para determinar la concentración de la hepcidina en la muestra, en el que el patrón interno comprende SEC ID Nº 4 isotópicamente marcada. En algunos ejemplos la hepcidina es una forma de prepropéptido de hepcidina que tiene aproximadamente 84 residuos de aminoácidos. En otros ejemplos, la hepcidina es una forma de propéptido de hepcidina que tiene aproximadamente 61 residuos de aminoácidos. En todavía otros ejemplos, la hepcidina es una forma procesada de hepcidina que tiene aproximadamente 20 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, la hepcidina es un péptido que tiene una secuencia de SEC ID Nº: 3; SEC ID Nº: 4; SEC ID Nº: 13; SEC ID Nº: 14; SEC ID Nº: 15, o una combinación de las mismas. La hepcidina se ioniza durante el análisis de EM, y la carga resultante de hepcidina puede ser +1, +2, +3, +4, o una mezcla de las mismas. El análisis de EM puede ser mediante cromatografía de líquidos-EM y/o EM en tándem. En algunas realizaciones, la hepcidina se separa adicionalmente de la muestra antes del análisis de EM. La separación puede producirse mediante cromatografía, tal como cromatografía de líquidos, y extracción en fase sólida.

En el presente documento se enseña un método de determinación de la presencia o concentración de hepcidina en una muestra que comprende separar la hepcidina de una muestra; someter la hepcidina a EM para producir un espectro de masas que tiene una señal correspondiente a la hepcidina; medir la intensidad de la señal de hepcidina; y correlacionar

la señal intensidad... [Seguir leyendo]

1. Un método de determinación de una concentración de hepcidina en una muestra que comprende (1) separar la hepcidina de la muestra antes de someter la hepcidina a espectrometría de masas usando extracción en fase sólida; (2)

someter la hepcidina y un patrón interno a espectrometría de masas en tándem para producir un espectro de masas que tiene una señal de hepcidina y una señal del patrón interno; (3) medir una intensidad de la señal de hepcidina y la señal del patrón interno; y (4) correlacionar la intensidad de la señal de hepcidina y la intensidad de la señal del patrón interno con una curva patrón de concentraciones de hepcidina para determinar la concentración de hepcidina en la muestra, en el que el patrón interno comprende SEC ID Nº 4 isotópicamente marcada.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la hepcidina comprende 20 a 25 residuos de aminoácidos.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la hepcidina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del

grupo que consiste en: SEC ID Nº: 3; SEC ID Nº: 4; SEC ID Nº: 13; SEC ID Nº: 14; SEC ID Nº: 15; y cualquier 15 combinación de las mismas.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la separación de hepcidina comprende introducir la muestra a una columna de fase inversa y tratar la columna de fase inversa con un disolvente eluyente, en el que un eluyente resultante comprende hepcidina, en el que el disolvente eluyente comprende metanol, agua, o mezclas de los mismos.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra es una muestra de plasma o una muestra de suero de un mamífero, y preferentemente un ser humano.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el ser humano sufre o se sospecha que padece una afección inflamatoria o 25 relacionada con inflamación.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la afección está seleccionada del grupo que consiste en septicemia, anemia de inflamación, anemia de cáncer, anemia inflamatoria crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, trastorno renal terminal, enfermedad renal crónica, anemia por deficiencia de hierro, enfermedad de la ferroportina, hemocromatosis,

diabetes, artritis reumatoide, arteriosclerosis, tumores, vasculitis, lupus eritematoso sistémico, hemoglobinopatías, trastornos eritrocitarios e insuficiencia renal.

8. El método de la reivindicación 5, en el que el ser humano sufre o se sospecha que padece una afección no inflamatoria. 35

9. El método de la reivindicación 8, en el que la afección no inflamatoria está seleccionada del grupo que consiste en deficiencia de vitamina B6, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de folato, pelagra, mielosis funicular, pseudoencefalitis, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad cardíaca coronaria y enfermedad arterial oclusiva periférica.

10. El método de la reivindicación 5, en el que el ser humano sufre o se sospecha que padece una reacción de fase aguda.

11. El método de la reivindicación 5, en el que el ser humano es hiposensible a terapia con eritropoyetina o una terapia 45 eritropoyética.

12. Un método que comprende determinar una concentración de hepcidina en una muestra de un paciente que padece anemia, en el que la determinación comprende separar la hepcidina de la muestra; añadir un patrón interno a la hepcidina; y determinar la concentración de hepcidina según el método de la reivindicación 1.

13. El método de la reivindicación 12, en el que la concentración de hepcidina es 10 ng/ml o menos, preferentemente 5 ng/ml o menos, y más preferentemente 1 ng/ml o menos.

14. El método de la reivindicación 12, en el que la concentración de hepcidina es 30 ng/ml o superior o 50 ng/ml o 55 superior.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que la hepcidina se ioniza por ionización por electropulverización (ESI) .