Método de cultivo de células B individuales y producción de anticuerpos específicos.

Método para obtener una célula B, que comprende las etapas siguientes:

a) obtener células B a partir de la sangre de un conejo,

b) marcar células B IgG+ y/o células B CD138+,

c) incubar las células B a 37ºC durante una hora en medio de cocultivo antes de depositar las células B marcadas en forma de células individuales,

d) cocultivar las células depositadas como células individuales con una célula nodriza en un medio de cocultivo,

e) seleccionar un clon de células B proliferante en la etapa d) y obtener de esta manera una célula B.

Método de cultivo de células B individuales y producción de anticuerpos específicos.

En la presente memoria se informa de un método para obtener la secuencia de aminoácidos de por lo menos los dominios variables de un anticuerpo monoclonal secretado por una única célula B que ha sido obtenida de una población de células B de un animal experimental mediante deposición de células individuales y cocultivo con células nodriza en presencia de una mezcla nutriente.

Antecedentes de la invención Para obtener células que secretan anticuerpos monoclonales, se utiliza ampliamente la tecnología de hibridoma desarrollada por Koehler y Milstein. Sin embargo, en la tecnología de hibridoma sólo puede fusionarse y propagarse una fracción de las células B obtenidas de un animal experimental inmunizado. De esta manera, se pierde una gran fracción de la diversidad de anticuerpos. La fuente de las células B generalmente es un órgano de un animal experimental inmunizado, tal como el bazo.

Zubler et al. en 1984 empezaron a desarrollar un enfoque diferente a la obtención de células que secretan anticuerpos monoclonales. En este enfoque, las células B se obtienen de la sangre del animal experimental inmunizado y se cocultivan con células nodriza EL-4 B5 murinas en presencia de una mezcla nutriente que comprende citoquinas. Con esta metodología pueden obtener hasta 50 ng/ml de anticuerpo tras 10 a 12 días de cocultivo.

Weitkamp J-H. et al. (J. Immunol. Meth. 275:223-237, 2003) informan de la generación de anticuerpos monoclonales humanos recombinantes contra rotavirus a partir de células B específicas de antígeno seleccionadas con partículas fluorescentes similares a virus. En el documento US nº 2006/0051348 se informa de un método para producir una pluralidad de anticuerpos aislados contra una pluralidad de antígenos afines. En los documentos WO nº 2008/144763 y nº 2008/045140 se informa de anticuerpos contra IL-6 y usos de los mismos y de un método de cultivo para obtener una población clonal de células B específicas de antígeno, respectivamente.

En el documento US nº 2007/269868 se informa de un método de cultivo para obtener una población clonal de células B específicas de antígeno. La clonación y expresión en E. coli de un fragmento Fab funcional obtenido de linfocitos humanos individuales contra la toxina del ántrax se informa en Masri S.A. et al. (Mol. Immunol. 44:21012106, 2007) . En el documento WO nº 2007/031550 se informa de un método para preparar bibliotecas de inmunoglobulinas. Tung J.W. et al. informan de que las rutas de desarrollo de células B fenotípicamente diferentes se corresponen con los tres linajes de células B en el ratón (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:6293-6298, 2006) .

Descripción resumida de la invención En la presente memoria se informa de un método para el aislamiento de una célula B a partir de una población de células B, en la que, en las cuatro semanas posteriores a la primera inmunización del animal experimental, pueden aislarse las células productoras de anticuerpos inducidas y puede determinarse la especificidad de unión de los anticuerpos.

Un aspecto informado en la presente memoria es un método para obtener un clon de células B, que comprende las etapas siguientes: a) obtener células B a partir de la sangre de un conejo, b) marcar células B-IgG+ y/o células B CD138+, c) incubar las células B a 37ºC durante una hora en medio de cocultivo antes de depositar las células B marcadas en forma de células individuales, d) cocultivar individualmente las células B depositadas como células individuales con células nodriza, e) seleccionar un clon de células B que prolifera y secreta anticuerpos en la etapa d) y obtener de esta manera un clon de células B.

En una realización adicional, el método comprende la etapa de centrifugar las células B depositadas como células individualmente antes del cocultivo. En todavía otra realización, el método comprende, tras la etapa a) y antes de la etapa b) , la etapa siguiente: ab) inmunoadsorción ("panning") de las células B con antígeno inmovilizado. Asimismo, en una realización la obtención se realiza mediante centrifugación en gradiente de densidad.

En una realización, el medio de cocultivo es un medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10% (v/v) , 1% (p/v) de una solución de glutamina 200 mM que comprende penicilina y estreptomicina, piruvato sódico 100 mM al 2% (p/v) , tampón de ácido 2- (4- (2-hidroxietil) -1-piperazín) -etanosulfónico 1 M al 1% (v/v) (HEPES) .

En una realización, el marcaje es de células B IgG+CD19+, células B IgG+CD38+, células B IgG+CD268+, células B IgG-CD18+, células B CD27+CD138+ ó células B CD3-CD27+. En otra realización, las células B se obtienen de un ratón y el marcaje es de células B IgG+CD19+ y/o de células B IgG-CD138+. En una realización adicional, las células B se obtienen de hámster y el marcaje es de células B IgG+IgM-. En todavía otra realización, las células B se obtienen de un conejo y el marcaje es de células B IgG+CD138+ y/o de células B IgG+IgM-.

En una realización, la célula nodriza es una célula B5 EL-4 murina.

En una realización, el cocultivo es en presencia de una mezcla nutriente. En una realización adicional, la mezcla nutriente es un sobrenadante de cultivo de timocitos. En otra realización, la mezcla nutriente comprende interleuquina-beta y factor alfa de necrosis tumoral. También en una realización, la mezcla nutriente comprende interleuquina-2 y/o interleuquina-10. En una realización, la mezcla nodriza comprende células de Staphylococcus aureus cepa Cowans. También una realización, la mezcla nutriente comprende interleuquina-21. En otra realización, la mezcla nutriente comprende factor de activación de células B de la familia del factor de necrosis tumoral (BAFF) . En una realización adicional, la mezcla nutriente comprende interleuquina-6. En todavía otra realización, la mezcla nutriente comprende interleuquina-4.

En una realización, el método comprende la etapa adicional de: f) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo producido por el clon de células B seleccionado de la etapa e) mediante una PCR con transcriptasa inversa y secuenciación de nucleótidos, obteniendo de esta manera una secuencia de aminoácidos de dominio variable de anticuerpo monoclonal.

En otra realización, la obtención de las células B es de un animal experimental entre 4 y 9 días después de la inmunización. También en una realización, el marcaje de las células B resulta en el marcaje de 0, 1% a 2, 5% de las células de la población total de células B.

También es un aspecto informado en la presente memoria un método para producir un anticuerpo, que comprende las etapas siguientes: a) proporcionar una población de células B maduras obtenidas a partir de la sangre de un conejo, b) marcar las células B IgG+ y/o las células B CD18+ de la población de células B con por lo menos un pigmento fluorescente (en una realización con uno a tres, o dos a tres pigmentos fluorescentes) , c) incubar las células B a 37ºC durante una hora en medio de cocultivo antes de depositar células individuales de la población marcada de células B en recipientes individuales (en una realización el recipiente es un pocillo de una placa multipocillo) , d) cultivar las células B individuales depositadas en presencia de células nodriza y una mezcla nutriente (en una realización, las células nodriza son células B5 EL-4; en una realización la mezcla nutriente es SCT natural; en una realización, la mezcla nutriente es una mezcla nutriente sintética) , e) determinar la especificidad de unión de los anticuerpos secretados en el medio de cultivo de las células B individuales, f) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio variable de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos de unión específica mediante una PCR con transcriptasa inversa y secuenciación de nucleótidos, obteniendo de esta manera un ácido nucleico codificante de dominio variable de cadenas ligera y pesada de anticuerpo monoclonal, g) introducir el ácido nucleico codificante de dominio variable de cadenas ligera y pesada de anticuerpo monoclonal en un casete de expresión para la expresión de un anticuerpo, h) introducir el ácido nucleico en una célula, i) cultivar la célula y recuperar el anticuerpo a partir de la célula o del sobrenadante de cultivo celular y de esta manera producir un anticuerpo.

Descripción detallada de la invención El método informado en la presente memoria permite una rápida caracterización de la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales individuales secretados por una población de células... [Seguir leyendo]

1. Método para obtener una célula B, que comprende las etapas siguientes:

a) obtener células B a partir de la sangre de un conejo, b) marcar células B IgG+ y/o células B CD138+, c) incubar las células B a 37ºC durante una hora en medio de cocultivo antes de depositar las células B marcadas en forma de células individuales, d) cocultivar las células depositadas como células individuales con una célula nodriza en un medio de cocultivo, e) seleccionar un clon de células B proliferante en la etapa d) y obtener de esta manera una célula B.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende la etapa de centrifugar antes del cocultivo las células individuales depositadas como células individuales.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el método comprende antes de la etapa de marcaje la etapa siguiente: ab) inmunoadsorción ("panning") de las células B con antígeno inmovilizado.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cocultivo se lleva a cabo en una placa multipocillo de poliestireno con pocillos recubiertos con un sustrato no fibroso preparado a partir de una mezcla de resina plástica polimérica y moléculas anfipáticas.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células B se obtienen mediante una centrifugación en gradiente de densidad.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la célula nodriza es una célula B5 EL-4 murina.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el medio de cocultivo comprende una mezcla nutriente.

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha mezcla nutriente es un sobrenadante de cultivo de timocitos.

9. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha mezcla nutriente comprende interleuquina-1beta y factor alfa de necrosis tumoral y por lo menos un compuesto seleccionado de entre interleuquina-2, interleuquina-10, células de Staphylococcus aureus cepa Cowan, interleuquina-21, BAFF, interleuquina-6, interleuquina-4, 5- (4fenoxibutoxi) psoraleno y otros compuestos estimuladores que incrementan la productividad de IgG del clon de células B sin reducir el número de pocillos IgG+.

10. Método para producir un anticuerpo, que comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar una población de células B maduras obtenidas a partir de la sangre de un conejo, b) marcar las células B IgG+ y/o las células B CD138+ con por lo menos un pigmento fluorescente, c) incubar las células B a 37ºC durante una hora en medio de cocultivo antes de depositar células individuales de la población marcada de células B en recipientes individuales, d) cultivar las células B depositadas como células individuales en presencia de células nodriza y una mezcla nutriente, e) determinar la especificidad de unión de los anticuerpos secretados en el medio de cultivo de las células B individualesf) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio variable de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo de unión específica mediante una PCR con transcriptasa inversa y secuenciación de nucleótidos, obteniendo de esta manera un ácido nucleico codificante del dominio variable de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo monoclonal, g) introducir el ácido nucleico codificante del dominio variable de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo monoclonal en un casete de expresión para la expresión de un anticuerpo, h) introducir el ácido nucleico en una célula, i) cultivar la célula y recuperar el anticuerpo a partir de la célula o del sobrenadante de cultivo celular y de esta manera producir un anticuerpo.