Método de cuantificación de un péptido y una proteína.

Un método de cuantificación de una proteína o un péptido por LC/MS/MS que comprende

a) la etapa que consiste en descomponer enzimáticamente la proteína,

en el caso en que el que deba cuantificarse una proteína;

b) utilizar, como sustancia patrón interno para LC/MS/MS, un péptido que es el péptido a cuantificar, o un péptido que proviene de la descomposición de la etapa a), pero que tiene un cambio en el orden de unión de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos; en el que los péptidos pueden ionizarse durante la fase MS del método.

Método de cuantificación de un péptido y una proteína.

Campo técnico La presente invención se refiere a un método de medición que puede cuantificar una proteína o un péptido específico, contenido en una cantidad traza, con una alta precisión y facilidad, e incluso sin utilizar ningún reactivo costoso.

Técnica anterior

Se sabe que el método ELISA, que utiliza un anticuerpo contra una proteína específica, es un método de cuantificación de una proteína específica contenida en una cantidad traza en una muestra de medición. Sin embargo, para preparar el anticuerpo, es necesario preparar un péptido o una proteína muy puros que sirvan como un antígeno y preparar un antisuero administrando el péptido o la proteína a un animal, y el procedimiento es por tanto muy dificultoso. Además, un anticuerpo puede reaccionar con una proteína altamente homóloga y por tanto es necesario examinar si solo se mide una proteína específica. Adicionalmente, la reactividad de una proteína con un anticuerpo varía debido a la desnaturalización térmica y similar. Por lo tanto, en un producto esterilizado, tal como un alimento, es imposible determinar el contenido proteico con una alta precisión incluso si se mide una proteína específica mediante el método ELISA como se ha descrito anteriormente.

Los métodos de análisis cuantitativo para proteínas, que se han desarrollado rápidamente en los últimos años, incluyen un método que utiliza espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida de alto rendimiento (en lo sucesivo en el presente documento denominado LC/MS/MS) . Se ha desarrollado un método para identificar una proteína que implica realizar la separación de una muestra que contiene muchos tipos de proteínas por electroforesis bidimensional y medir los péptidos mediante LC/MS/MC obtenidos mediante un tratamiento enzimático de las manchas resultantes. Si la medición se realiza mediante LC/MS/MC, existen las siguientes ventajas: es posible reducir las etapas de tratamiento previo porque no se necesita la derivatización, necesaria en una GC/MS (Cromatrografía de Gases/Espectrometría de Masas, por las siglas en inglés Gas Chromatography/Mass Spectrometr y ) convencional; y es posible medir un compuesto polimérico tal como una proteína o un péptido. En un método de identificación de una proteína por LC/MS/MS, la identificación de la puede realizarse: determinando la masa de un fragmento peptídico producido a partir de una proteína de la muestra utilizando una proteasa específica mediante la primera MS; fragmentar el péptido; realizar la segunda MS para predecir la secuencia de aminoácidos del péptido y comparar con una base de datos todas las secuencias peptídicas predichas.

Al igual que el método de cuantificación de una proteína mediante LS/MS/MS, se ha descrito un método que implica marcar con deuterio un aminoácido en un péptido diana y medir el aminoácido (véase, por ejemplo, el Documento No de Patente 1) . Sin embargo, en este método, como sustancia patrón interna, se utiliza el aminoácido marcado con deuterio y dado que marcar los aminoácidos con deuterio es muy costoso y poco habitual, la síntesis peptídica utilizando el método puede limitar su aplicación.

Además, se describe un método de detección mediante LC/MS/MS de una proteína derivada de animales en una mezcla compleja (véase, por ejemplo, el documento de Patente 1) . Sin embargo, este método presenta el inconveniente de eliminar sustancias de interferencia y conservar el nivel de contaminantes a un bajo nivel y también requiere procedimientos engorrosos.

Se requiere un método de medición que pueda cuantificar una proteína o un péptido específico contenido en una cantidad traza con una alta precisión y facilidad, incluso sin utilizar ningún reactivo costoso.

[Documento de Patente 1] JP 2005-513481 B

[Documento No de Patente 1] David R. Barnidge et al., Analytical Chemistr y , Vol. 75, Nº 3, 2003

C. Carlsson et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 34, Nº 2, 2004 describen la determinación de gabapentina por espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida utilizando, como patrón interno, un isómero estructural de gabapentina, en el que la gabapentina y el patrón interno tienen la misma masa monoisotópica exigida, que sin embargo puede detectarse individualmente ya que tiene distintos modelos de fragmentación.

Descripción de la invención

Problemas a resolver por la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un método de medición que pueda cuantificar una proteína o un péptido con facilidad y mayor precisión y sin utilizar ningún reactivo costoso.

Medios para resolver los problemas Los autores de la presente invención han buscado un método de medición que pueda cuantificar una proteína o un péptido con una mayor precisión. Como resultado, los autores de la presente invención han descubierto el siguiente método. En el caso de medir una proteína A, primero, la proteína A se descompone con una enzima para producir un péptido B. Una parte de la secuencia de aminoácidos del péptido B se reemplaza para producir un péptido C, y la medición se realiza por LC/MS/MS utilizando, como patrón interno, el péptido C. Mientras tanto, en el caso en el que la proteína A esté separada de una muestra de medición y después se descomponga con una enzima, para corregir la tasa de recuperación en la operación de separación, se requiere una proteína que tenga propiedades similares a las de la proteína A como patrón interno para la proteína A. Por lo tanto, una proteína D que es más similar a la proteína A, pero que no es la proteína A, puede obtenerse reemplazando la secuencia del péptido B en la proteína A mediante la secuencia del péptido C. Los autores de la presente invención han descubierto que el péptido B puede medirse de la misma manera que en el caso de utilizar el péptido C utilizando, como patrón interno, la proteína D. Como se ha descrito anteriormente, los autores de la presente invención han descubierto que una proteína o un péptido a medir puede cuantificarse mediante LC/MS/MS utilizando, como patrón interno, un péptido obtenido cambiando una parte del orden de unión de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de un péptido específico en una proteína a medir sin cambiar la mayoría de las propiedades del péptido original y este hallazgo por tanto permite completar la presente invención.

Cambiando el orden de unión de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos en un péptido específico de una proteína a medir, el péptido específico en la proteína a medir y el péptido patrón interno se comportan como sustancias que tienen el mismo peso molecular en la primera MS, y los dos péptidos pueden separarse basándose en la diferencia en las secuencias de aminoácidos en la segunda MS. Basándose en la proporción de las intensidades de señal de los péptidos respectivos determinadas por la segunda MS, la concentración de la proteína a medir puede cuantificarse. El método de medición de la presente invención puede mejorar la precisión de la medición en comparación con una MS de una sola etapa porque la selección basada en la masa se realiza en dos etapas. Adicionalmente, el método puede confirmar que sólo se mide una proteína específica porque la información en la secuencia de aminoácidos puede obtenerse en cualquier momento mediante la segunda MS. Mientras tanto, un método convencional en el que, como patrón interno, se utiliza un péptido que incluye un aminoácido marcado con deuterio, se realiza cambiando al mismo tiempo la medición de un péptido diana y la medición del péptido patrón interno en la primera MS, dando como resultado la disminución de la precisión en la medición. Por otro lado, el método de la presente invención puede realizarse con una alta precisión porque el peso molecular del péptido diana es el mismo que el del péptido patrón interno. Como se ha descrito anteriormente, el método de la presente invención puede realizarse únicamente cambiando el orden de unión de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos y por tanto el método de análisis es fácil. Además, la medición puede realizarse sin utilizar ningún reactivo costoso. Además, el péptido patrón interno puede prepararse utilizando un sintetizador peptídico existente, y por tanto, en cuanto a costes, el método de la presente invención tiene una ventaja sobre el método de medición convencional.

Una proteína obtenida reemplazando la secuencia de aminoácidos se prepara muy fácilmente reemplazando la secuencia a nivel genético de acuerdo con el desarrollo de la tecnología genética. Si como patrón interno puede... [Seguir leyendo]

1. Un método de cuantificación de una proteína o un péptido por LC/MS/MS que comprende a) la etapa que consiste en descomponer enzimáticamente la proteína, en el caso en que el que deba cuantificarse una proteína; b) utilizar, como sustancia patrón interno para LC/MS/MS, un péptido que es el péptido a cuantificar, o un péptido que proviene de la descomposición de la etapa a) , pero que tiene un cambio en el orden de unión de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos; en el que los péptidos pueden ionizarse durante la fase MS del método.

2. Un método de cuantificación de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, pero en el que la sustancia patrón interno utilizada para la LC/MS/MS es, en cambio, una proteína que comprende el péptido de la sustancia patrón interno de la etapa b) de la reivindicación 1.

3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en el que la proteína a medir es una cualquiera de lactoferrina bovina, lactoperoxidasa bovina, angiogenina bovina y cistatina C bovina.