MEDIO DE CULTIVO CELULAR ÚTIL PARA LA PROLIFERACIÓN IN VITRO DE CÉLULAS DEL EPITELIO DEL LIMBO ESCLEROCORNEAL.

Medio de cultivo celular útil para la proliferación in vitro de células de epitelio del limbo esclerocorneal.

La presente invención proporciona un medio de cultivo celular carente de componentes de origen animal no humano y de compuestos nocivos para el organismo humano, útil para la proliferación in vitro de células de epitelio del limbo esclerocorneal, tanto de las células epiteliales diferenciadas o en proceso de diferenciación como de las células madre presentes entre ellas. Por tanto, las células cultivadas en el medo de cultivo de la invención pueden ser aplicadas de forma segura en clínica, por ejemplo, en procedimientos de terapia celular para la regeneración epitelial de la superficie ocular, preferiblemente en los casos de Síndrome de Insuficiencia Límbica (SIL).

Medio de cultivo celular útil para la proliferación in vitro de células del epitelio del limbo esclerocorneal

La presente invención se encuadra en el campo de la terapia celular,

específicamente dentro de los medios de cultivo celulares útiles para expandir y cultivar in vitro células del epitelio del limbo esclerocorneal que posteriormente puedan ser aplicadas de forma segura en clínica durante procedimientos de regeneración tisular de la superficie ocular.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La superficie ocular está definida como una unidad anatómica, histológica, fisiológica y patológica que está constituida por la película lagrimal y por el epitelio de la conjuntiva, del limbo esclerocorneal (en adelante, limbo) y de la 15 córnea junto con los tejidos conectivos adyacentes. La córnea es uno de los tejidos avasculares y transparentes del globo ocular que permite que la luz llegue hasta la retina, por lo que mantener intacta su estructura es esencial para poder generar una visión normal. Sin embargo, su contacto directo con el exterior y con los rayos ultravioletas produce un continuo desgaste de su epitelio que hace fundamental la continua regeneración del mismo. La regeneración del epitelio corneal se produce gracias a la existencia de células madre que se localizan en el epitelio limbar y que son las llamadas células madre epiteliales limbares (CM EL) .

El limbo es la zona de transición entre la córnea y la conjuntiva. El limbo tiene dos capas, una epitelial superficial y una estromal profunda. La capa epitelial del limbo está formada por 8 -12 capas de células escamosas no queratinizadas, siendo las más superficiales similares, al menos en apariencia, al epitelio corneal, con la diferencia de que se acompañan de células melanocíticas y de Langerhans. Sus células basales son más cuboidales y se adentran en el interior de la matriz estromal subyacente. Debajo del epitelio limbar se sitúa la membrana basal, que permite el paso de factores de crecimiento y citoquinas desde el estroma al epitelio. Debajo de la membrana basal se encuentra el estroma limbar, formado por fibras de colágeno, proteoglicanos y glicoproteínas, donde residen múltiples tipos celulares como melanocitos, macrófagos, mastocitos, linfocitos, células mesenquimales, fibroblastos y células plasmáticas. Además, la capa estromal contiene vasos sanguíneos, linfáticos y fibras nerviosas, que desempeñan entre otras funciones aportar a las CMEL los nutrientes necesarios. Anatómicamente, en el limbo se pueden encontrar las empalizadas de Vogt, estructuras compuestas por crestas de tejido fibrovascular orientadas en sentido radial y alternadas entre capas de epitelio limbar. Hay múltiples evidencias clínicas y de laboratorio que sugieren que en las capas basales del epitelio limbar se encuentran las células madre del epitelio corneal. Se ha propuesto que las células madre se localizan en un microambiente altamente especializado en su conservación y mantenimiento, denominado nicho de células madre, localizado en las zonas más basales de las empalizadas de Vogt.

La constante renovación del epitelio corneal se produce por una migración de las CMEL desde el nicho limbar al epitelio corneal durante la cual se van produciendo diferentes estadíos de diferenciación celular, encontrando las células más diferenciadas en las capas superficiales del epitelio corneal.

Las CMEL son células indiferenciadas, con capacidad de autorrenovación ilimitada y capacidad de diferenciarse a otros linajes celulares. Además, presentan un tamaño celular pequeño, un ratio núcleo citoplasma alto y ausencia de marcadores específicos de células epiteliales corneales diferenciadas, como las citoqueratinas (K) 3 Y 12.

En ocasiones, las CMEL o su nicho pueden verse alteradas/o por diferentes causas, entre las que se incluyen causas primarias, más raras, en las que falla principalmente el nicho limbar (aniridia congénita y displasias ectodérmicas) , y causas secundarias, mucho más frecuentes, como causticaciones químicas o térmicas, radiaciones ultravioleta o ionizantes, conjuntivitis cicatrizantes (como el sindrome de Stevens-Johnson, penfigoide de las membranas mucosas, rosácea, etc) , múltiples cirugias, secuelas e infecciones extensas, abuso de lentes de contacto, pterigia, etc. Estas alteraciones en las CMEL o en su nicho producen una entidad clinica denominada deficiencia de células madre del 5 limbo o sindrome de insuficiencia limbica (SIL) . Esta patologia, que puede ser unilateral o bilateral (afectando a un solo ojo o a ambos) y total o parcial (afectando a la totalidad del anillo limbar o solo a una región del mismo) , se caracteriza por la conjuntivalización, vascularización, inflamación y opacificación de la córnea, lo que produce un sindrome de dolor crónico y en numerosas ocasiones pérdida parcial o completa de la visión.

A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes técnicas para el tratamiento del SIL, entre las que encontramos la queratoplastia penetrante, los injertos de membrana amniótica, el trasplante de tejido limbar y, más recientemente, el 15 trasplante de células limbares epiteliales (entre las que se encuentran las CMEL) expandidas y cultivas in vitro. El objetivo de estas técnicas es eliminar las alteraciones de la superficie ocular y obtener una nueva fuente de células madre que sean capaces de regenerar el epitelio corneal de forma fisiológica. Sin embargo, las dos primeras técnicas mencionadas solo cumplen el primero 20 de los objetivos y de forma temporal. Por otro lado, un trasplante de tejido limbar en casos de SIL unilateral, en el que normalmente el tejido donante procede del ojo contralateral del propio paciente (trasplante autólogo) , implica pérdida de tejido limbar del ojo sano, lo que supone riesgo de desarrollar SIL bilateral. Si por el contrario el trasplante es realizado en pacientes con daño 25 bilateral, en los cuales el tejido limbar procede de un donante compatible vivo o cadáver (trasplante alogénico) , el mayor problema es el riesgo de rechazo inmune (ocasionando vascularización e inflamación) , que hace necesaria una inmunosupresión sistémica mantenida durante al menos tres años y, en muchas ocasiones, incluso de por vida, lo que ocasiona gastos sanitarios importantes en morbilidad, visitas médicas, analiticas repetidas, etc.

Una forma de minimizar la posible lesión del ojo donante, en el caso de los trasplantes autólogos, y el riesgo de inflamación y rechazo, en el caso de los trasplantes alogénicos, es realizar un trasplante de células epiteliales limbares expandidas y cultivadas in vitro, ya que la cantidad de tejido limbar necesario para realizar el cultivo celular es mínima y los cultivos celulares obtenidos a partir de estos tejidos tienen muy pocas células presentadoras de antígenos, lo que disminuye su inmunogenicidad (Femández A., et al., 2008, An Sist Sanit Navar., 31: 53-69; Shortt AJ., et al., 2007, Surv Ophthalmol. , 52: 483-502; Burman S., Sangwan V., 2008, Clín Ophthalmol., 2: 489-502) .

El procedimiento realizado para llevar a cabo el trasplante de células epiteliales limbares cultivadas in vitro consiste en el aislamiento de células epiteliales limbares del nicho limbar donante, entre las que se encuentran las CMEL, su posterior expansión y cultivo in vitro, normalmente sobre membrana amniótica,

y finalmente el trasplante del complejo membrana amniótica-células epiteliales limbares a la superficie ocular del receptor.

Aunque el trasplante de células epiteliales limbares cultivadas in vitro es la mejor estrategia terapéutica que existe actualmente para el tratamiento de SIL

Y se realiza de forma relativamente frecuente en estos casos, la metodología utilizada para ello está en continua controversia. Así, en la actualidad existen unos 20 ensayos clínicos en los que se han utilizado este tipo de trasplantes y entre todos ellos existen numerosas variantes.

Actualmente, se utilizan principalmente dos métodos para establecer un cultivo primario de células epiteliales limbares. Por un lado, la obtención de biopsias de la zona limbar que son directamente sembradas (explantes) , y por otro lado, la obtención de células epiteliales limbares en suspensión por tratamientos enzimáticos, bien a partir de explantes o bien a partir de porciones mayores del

anillo limbar, que posteriormente son sembradas.

Además del método de obtención de las células del nicho limbar, están en continua controversia las condiciones de cultivo en las que se tienen que mantener dichas células durante su cultivo in vitro. En la actualidad, el sustrato más utilizado para el cultivo y expansión in vitro de este tipo celular es la 5 membrana amniótica, por ser antiinflamatoria,... [Seguir leyendo]

1. Medio de cultivo celular que comprende un medio base suplementado

con:

5

a. entre 20 y 100 ¡.tg/ml de al menos un compuesto antibacteriano,

b. entre 0, 25 y 10 ¡.tg/ml de al menos un compuesto antifúngico,

c. entre 0, 25 ~lg/ml y 10 ¡.tg/ml de insulina recombinante humana o

de IGFs,

10 d. entre 0, 1 Y 10 ~lg/ml de un compuesto esteroide,

e. entre 2 y 20 ng/ml de al menos un factor de crecimiento que

active los receptores de EGF,

f. entre 10-7 y 10-5 M de isoproterenol,

g. entre 0, 15 Y 0, 2 mM de adenina,

15 h. entre 10-10 y lOx10-9 M de al menos una hormona tiroidea, y

1. entre 5 y 20% de suero humano.

2. Medio de cultivo celular según la reivindicación 1 donde el suero

humano es de origen autólogo.

20

3. Uso del medio de cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones

1 ó 2 para la proliferación in vitro de células del epitelio del limbo

esclerocorneal.

25 4. Uso del medio de cultivo celular según la reivindicación 3 donde las

células del epitelio del limbo esclerocorneal son células madre.

5. Uso del medio de cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones

3 ó 4 donde las células del epitelio del limbo esclerocorneal proceden de

30 un humano.

6. Uso del medio de cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones

a 5 donde las células del epitelio del limbo esclerocorneal son de origen autólogo.

7. Método para la proliferación in vitro de células del epitelio del limbo esclerocorneal que comprende:

a. sembrar células del epitelio del limbo esclerocorneal en un sustrato, y

b. cultivar las células del paso (a) en presencia del medio de cultivo celular descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

8. Método según la reivindicación 7 donde el sustrato del paso (a) es un biomaterial.

9. Método según la reivindicación 7 donde el sustrato del paso (a) es plástico.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 donde las células del epitelio del limbo esclerocorneal son células madre.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 donde las células del epitelio del limbo esclerocorneal proceden de un humano.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 donde las células del epitelio del limbo esclerocorneal son de origen autólogo.

13. Célula obtenible mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

14. Población celular que comprende la célula según la reivindicación 13.

15. Uso de la célula según la reivindicación 13 o de la población celular según la reivindicación 14 para la elaboración de un medicamento.

16. Uso de la célula o de la población celular según la reivindicación 15 donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de lesiones

o enfermedades degenerativas, inflamatorias o genéticas de la superficie 5 ocular.

17. Uso de la célula o de la población celular según la reivindicación 16 donde la superficie ocular es la córnea.

18. Uso de la célula o de la población celular según la reivindicación 17 donde la enfermedad es el Síndrome de Insuficiencia Límbica.

19. Composición farmacéutica que comprende la célula según la reivindicación 13 o la población celular según la reivindicación 14. 15

20. Composición según la reivindicación 19 que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21.Composición según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 que 20 además comprende otro principio activo.