Medio de cultivo adecuado para la proliferación de células madre neurales.

Medio de cultivo adecuado para la proliferación de células madre neurales.

Esta invención está relacionada con el empleo del compuesto 3,l2-di-O-acetil-8-O-tigloilingol (de aquí en adelante ELAF) o una sal farmacológicamente activa de dicho compuesto, para favorecer la proliferación de precursores neurales o células madre neurales en cultivo. Concretamente está relacionada con un medio de cultivo adecuado pan la proliferación de células madre neurales o precursores neurales in vitro que comprende el compuesto 3,12-di-O-acetil-8-O-tigloilingol y/o una sal farmacológicamente activa del mismo.

MEDIO DE CULTIVO ADECUADO PARA LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS MADRE NEURALES.

SECTOR DE LA TÉCNICA

Esta invención está relacionada con el empleo del compuesto 3, 12-di-O-acetil-8-0tigloilingol (de aquí en adelante ELAF) o una sal farmacológicamente activa de dicho compuesto, para favorecer la proliferación de precursores neurales o células madre neurales en cultivo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La existencia de regeneración de lesiones a partir de células madre neurales en el sistema nervioso central, se ha descrito principalmente en modelos de isquemia transitoria global o focal, epilepsia y en lesiones por traumatismo craneal, entre otras. Así en modelos de isquemia, se ha comprobado que en la zona lesionada, aparecen nuevas neuronas que se han podido generar in situ por activación de células madre locales, o como resultado de la migración de precursores desde las áreas neurogénicas (giro dentado y zona subventricular) . En un modelo de isquemia transitoria global se ha observado un aumento de la proliferación de precursores neurales en el giro dentado (Liu, J. et al. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. J Neurosci 18:7768-7778, 1998) y un efecto similar puede observarse en modelos de isquemia focal (Jin, K. et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rato Proc Natl Acad Sci USA 98:4710-4715, 2001) , así como en modelos de epilepsia (Parent, J.M et al. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci.17:3727-3738, 1997) . De forma similar, el efecto se observa en otra de las zonas neurogénicas, la zona subventricular (Fallon, J. et al. In vivo induction o[massive proliferation, directed migration, and differentiation o[ neural cells in the adult mammalian brain. Proc Natl Acad Sci USA 97:14, 68614, 691, 2000) . Los precursores neurales proliferantes en estas regiones neurogénicas, estimulados tras la lesión, dan lugar a la producción de nuevos neuroblastos que, eventualmente, migran en dirección a la zona lesionada. Cualquiera que sea su origen, la capacidad de regeneración es muy escasa, habiéndose descrito una reposición neuronal entre 0, 2 y 10%, según el área afectada y el tipo de lesión (Arvidsson, A. et al. Neuronal replacement [rom endogenous precursors in the adu/t brain after stroke. Nat Med 8:963-970, 2002; Nakatomi, H et al. Regeneration o[ hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injur y , by recruitment o[ endogenous neural progenitors. Cell 110:429-441, 2002; Teramoto, T. et al. EGF

amplifies the replacement of parvalbuminexpressing striatal interneurons after ischemia. J Clin Invest. 111:1125-1132, 2003) . El hecho de que haya una respuesta neurogénica a la lesión hace pensar que la formación de nuevas neuronas sea un mecanismo eficaz en la reparación de pequeñas lesiones, que permanecen silentes precisamente porque las neuronas que hacen apoptosis son reemplazadas, al menos en parte, por neuronas de nueva formación. Un estudio reciente demuestra que en los animales que han sufrido un traumatismo craneal, se incrementa la neurogénesis en el giro dentado del hipocampo y posteriormente estos animales recuperan su capacidad de realizar tareas de memoria especial. Sin embargo, si en estos animales se eliminan selectivamente las células madre que comienzan a dividirse en el hipocampo como consecuencia del daño inducido por el traumatismo, estos animales no pueden recuperar la capacidad para realizar tareas de memoria espacial (Blaiss CA, Yu TS, Zhang G, Chen J, Dimchev G, Parada LF, Powell CM, Kernie SG. Temporally specified genetic ablation of neurogenesis impairs cognitive recover y after traumatic brain injur y . J N eurosci. 2011 31 :4906-4916) , demostrando así que la reposición neuronal en estas regiones tiene un efecto sobre la recuperación de la memoria tras un traumatismo craneal. Adicionalmente, la aparición de neurogénesis en lesiones cerebrales, se ha demostrado también en humanos, concretamente se ha podido observar que en muestras de cerebro de pacientes sometidos a cirugía tras una lesión por traumatismo craneal, aparecen en la zona de la corteza cerebral alrededor de la lesión, células madre neurales proliferantes y neuroblastos (Zheng W, Zhuge Q, Zhong M, Chen G, Shao B, Wang H, Mao X, Xie L, Jin K. Neurogenesis in Adult Human Brain after Traumatic Brain Injur y . J Neurotrauma. 2011. [Epub ahead of print]

Sin embargo, las lesiones graves o las experimentales con mayor pérdida neuronal no pueden ser resueltas, a menos que se establezcan medidas terapéuticas eficaces para incrementar de forma significativa el proceso neurogénico. Una de las alternativas que podría contribuir a resolver, los problemas clínicos que plantean las enfermedades que cursan con pérdida neuronal es el transplante de células madre que puedan posteriormente generar nuevas neuronas. Varios laboratorios han intentado esta estrategia en modelos animales a los que se han transplantado células madre de origen embrionario (Cao et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adu/t rat spinal cord are restricted to a gliallineage. Exp Neurol.167:48-58, 2001) , células madre neurales de animales adultos (Pluchino, S. et al. Injection of adu/t neurospheres induces recover y in a chronic model ofmultiple sclerosis. Nature 422: 688-694, 2003) , o bien células procedentes de células madre sometidas a diferentes grados de diferenciación in vitro. El fenómeno más generalmente observado es que, las células madre que se implantan en las zonas neurogénicas del cerebro (por ejemplo, la zona subventricular o el bulbo olfativo en roedores) se diferencian a neuroblastos y se convierten en neuronas maduras pero no ocurre este mismo fenómeno en las zonas no neurogénicas del cerebro. (Herrera, D. G. et al. Adult-derived neural precursors transplanted into multiple regions in the adult brain. Ann Neurol. 46:867-77, 1999; Mligiliche, NL.. et al. Survival of neural progenitor cells from the subventricular zone of the adult rat after transplantation into the host spinal cord of the same strain of adult rato Anat Sci Int. 80:229-34, 2005) .

Por 10 tanto uno de los problemas con el que se enfrenta la presente invención, es que, si bien las células madre que se implantan en las zonas neurogénicas del cerebro (por ejemplo, la zona subventricular o el bulbo olfativo en roedores) se diferencian a neuroblastos y se convierten en neuronas maduras, cuando el transplante se produce en otras zonas, inician la ruta de diferenciación glial. En las lesiones que ocurren en zonas no neurogemcas aparecen precursores neurales proliferantes que posteriormente podrían diferenciarse y la fuente endógena de precursores neurales en estas regiones es la glía parenquimal. Estas células de glía se activan tras una lesión y dan lugar a precursores neurales la mayoría de los cuales se diferencian a células de glía y muy pocas a neuronas.

Adicionalmente y sin peIjuicio de lo anterior, la presente invención también se enfrenta al problema de elegir la fuente de los precursores a trasplantar a la hora de realizar este tipo de trasplantes. Las células madre embrionarias diferenciadas in vitro a células madre neurales o los precursores neurales fetales son una de las fuentes más abundante. Sin embargo, no es fácil encontrar donantes de precursores embrionarios y fetales por lo que sería de gran utilidad poder aislar precursores neurales de cerebro adulto, cultivarlas y expandirlas in vitro para su posterior uso en trasplantes. Así, identificar agentes que favorezcan la expansión de los precursores neurales en cultivo resultará de gran utilidad en el desarrollo de terapias regenerativas del sistema nervioso.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig 1. Ensayo de neuroesferas: efecto de ELAF sobre cultivos de precursores neurales in vitro. A. Imágenes de microscopía de contraste de fase representativas de cultivos de precursores neurales crecidos en presencia y ausencia de ELAF (10 J.lM) . En todos los casos la proliferación se estimulaba mediante la adición de los factores de crecimiento EGF+bFGF al medio de cultivo. B. Efecto de concentraciones crecientes de ELAF sobre el tamaño de las neuroesferas (* p<O.OI en Test T -student en relación al control sin ELAF) . C. Efecto de ELAF (10 J.lM) sobre el número total de células en los cultivos de neuroesferas.

Fig 2. Ensayo de neuroesferas: efecto de ELAF sobre cultivos de precursores neurales in vitro en presencia del inhibidor de las isoformas clásicas y nóveles de PKC G06850. A. Imágenes de microscopía de contraste de fase representativas de cultivos... [Seguir leyendo]

1. Medio de cultivo adecuado para la proliferación de células madre neurales o precursores neurales in vitro, que comprenda el compuesto 3, 12-di-O-acetil5 8-0-tigloilingol y/o una sal farmacológicamente activa del mismo.

2. Medio de cultivo según la reivindicación 1, que además comprenda el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y/o el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y donde el compuesto 3, 12-di-O-acetil-8-0-tigloilingol y/o la sal farmacológicamente activa del mismo se hallen en el medio en un rango de concentración de 1 pmol/L a 40 ¡..tmollL.

3. Uso del medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para favorecer la proliferación de precursores neurales o células madre neurales en cultivo.