Materiales y métodos para producción eficiente de ácido láctico.

Cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende las siguientes modificaciones genéticas para la cepa de E.

coli KO11 (ATCC 55124):

a) inserción del gen casAB de Klebsiella oxytoca detrás del codón de terminación de lacY;

b) integración del gen celY de Erwinia chrysanthemi en el gen frdA;

c) inactivación o deleción de focA-Z. mobilis pdc-adhB-5 pflB;

d) inactivación o deleción del gen de alcohol deshidrogenasa de E. coli nativa; y

e) inactivación o deleción del gen de acetato-quinasa (ackA).

Materiales y métodos para producción eficiente de ácido láctico Antecedentes de la invención [0001] El ácido láctico se usa comúnmente como aditivo alimenticio para la conservación, el sabor y la acidez. El ácido láctico también se usa en la producción de plástico biodegradable, a saber, ácido poliláctico (PLA) . El uso de PLA como alternativa renovable para productos a base de petróleo se está expandiendo rápidamente (Agrawal, 2003) . Las propiedades físicas y el índice de degradación biológica del PLA se puede controlar mediante la manipulación de la proporción de los sustratos quirales, ácido láctico D y ácido láctico L (Narayanan et al., 2004) . El mercado global del ácido láctico se estima que tiene un exceso de 100.000 toneladas al año y se espera que aumente sustancialmente en los próximos años según empiecen a funcionar nuevas instalaciones de PLA.

Por ejemplo, la demanda de lactato de etilo solvente biodegradable (un derivado del ácido láctico) está previsto que aumente sustancialmente en un futuro próximo. Se estima que los ésteres de lactato podrían potencialmente reemplazar hasta el 80% de los 3, 8 millones de toneladas de solventes que se usan cada año en EEUU. Este solvente no es tóxico y tiene muchas aplicaciones útiles, incluyendo la fabricación electrónica, pinturas y recubrimientos, tejidos, limpiadores y desengrasantes, adhesivos, impresión y destintado.

Los métodos fermentativos para producir ácido láctico suelen preferirse a la síntesis química, que produce una mezcla de los isómeros D y L. Los productos de fermentaciones microbiológicas dependen del organismo usado. La fermentación microbiológica puede producir una mezcla de los dos isómeros o ácido láctico ópticamente puro en una forma esteroespecífica. La estereoespecificidad deseada del producto depende del uso al que esté destinado.

Las fermentaciones bacterianas con lactobacilos son comunes en la producción industrial de ácido láctico, pero estas fermentaciones raramente producen un producto ópticamente puro. Adicionalmente, la naturaleza fastidiosa de estas bacterias requiere que se añadan cantidades considerables de nutrientes adicionales al medio de crecimiento, lo que supone un coste adicional y hace más difícil la purificación. Por otra parte, los métodos de fermentación para producir ácido láctico son altamente ineficientes y debe mejorarse para asegurar la viabilidad económica de las expansiones de mercado mencionadas anteriormente.

La levadura no es capaz de producir niveles apreciables de ácido láctico, aunque se han descrito cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes que contienen el gen de ldh de Lactobacillus o de orígenes bovinos (patente WO 99/14335 y Adachi et al., 1998) . A la vez que son capaces de producir hasta 2-4% (p/v) de ácido láctico, estas cepas muestran una productividad pobre y una parte significante de la glucosa se convierte en etanol.

El Rhizopus or y zae de hongo filamentoso (sinónimo de R. arrhizus) también se usa para la producción industrial de ácido láctico. El R. or y zae es capaz de convertir aeróbicamente glucosa, en un medio químicamente definido, en grandes cantidades de ácido L- (+) -láctico ópticamente puro. La investigación en la producción de ácido láctico mediante Rhizopus ha continuado principalmente por la facilidad de purificación del producto en un medio de crecimiento mínimo y la capacidad del hongo para utilizar ambos carbohidratos complejos y azúcares de pentosa (patente estadounidense Nº. 4.963.486) . Esto permite que se utilice el hongo para la conversión de biomasa agrícola de bajo valor en ácido láctico. Desafortunadamente, la capacidad para modificar la producción de ácido láctico por modificación genética en el Rhizopus y otros hongos ha sido limitada.

Los biocatalizadores basados en la K-12 de Escherichia coli han sido creados genéticamente para la producción de D- (-) -lactato pero fueron incapaces de fermentar 10% de la glucosa o la sacarosa para complejarlas en el complejo o medio mínimo (Chang et al., 1999 Dien et al., 2001 Zhou et al., 2003 Zhu y Shimizu 2004) .

Uno de los biocatalizadores de E. coli, SZ63 (pLOI3501) , se desarrolló para fermentación de sacarosa mediante expresión funcional de los genes cscR' cscA' cscKB' de E. coli B en un plásmido (Shukla et al. 2004) . Aunque fue capaz de fermentación eficaz del 5% de glucosa o sacarosa, este biocatalizador metabolizó concentraciones de azúcar más altas de forma incompleta y se requirió selección antibiótica continua para el mantenimiento del plásmido.

Otros biocatalizadores derivados de la cepa B de E. coli, tales como K011 (número de depósito ATCC 55124) , tienen la capacidad nativa de fermentar sacarosa (Moniruzzaman et al., 1997) . Como con la cepa SZ63, este biocatalizador metaboliza concentraciones de azúcar más altas de forma incompleta y se requiere selección antibiótica continua para el mantenimiento del plásmido.

Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad de biocatalizadores de ácido láctico mejorados con aumento de los índices de fermentación, el título del producto y los rendimientos para reducir los costes asociados a la producción de base biológica de productos químicos (Arntzen et al., 1999 Chotani et al., 2000 Datta et al., 1995 Hofvendahl y Hahn-Hagerdal, 2000 y Ohara et al., 2001) .

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona microorganismos nuevos útiles para la producción de ácido láctico. Adicionalmente, la presente invención proporciona constructos nuevos para su uso en la transformación de cualquiera de los numerosos organismos huésped, preferiblemente Escherichia coli, que expresan y/o suprimen genes determinados para producir ácido láctico cuando el organismo huésped se cultiva en un medio fermentable. Por consiguiente, los materiales y métodos de la presente invención pueden utilizarse para mejorar la producción del ácido láctico en organismos huésped, proporcionando de este modo un mayor suministro de ácido láctico para su uso en aplicaciones alimentarias e industriales.

En formas de realización determinadas, se construyen derivados del Escherichia coli etanologénico (también denominados en este caso E. coli) K011 para la producción de D- (-) -lactato. En otras formas de realización de la invención, E. coli se crea genéticamente conforme a la presente invención para la producción de L- (+) -lactato.

Conforme a la presente invención, los nuevos biocatalizadores basados en K011 de E. coli se preparan mediante deleción de los genes que codifican las vías rivales seguida de una selección basada en el crecimiento para mutantes con rendimiento mejorado para fermentar glucosa y/o sacarosa.

Los microbios creados genéticamente de la invención preferiblemente contienen genes nativos para la utilización de sacarosa. Ciertas cepas de E. coli creadas genéticamente de la invención pueden fermentar 10% de glucosa o sacarosa para producir más de 1 mol de D- (-) -lactato/1 de caldo de fermentación, con rendimientos basados en azúcar metabolizado que varía de aproximadamente 88% a aproximadamente 95%, dependiendo del caldo de fermentación. Otras cepas de E. coli creadas genéticamente de la invención pueden fermentar glucosa o sacarosa para producir L- (+) lactato.

Se desprenderán más ventajas de esta invención de la descripción siguiente.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-1F ilustran gráficamente la diferencia de actividad entre una forma de realización de la invención y la cepa SZ63.

Las figuras 2A-2D ilustran el progreso de la producción de ácido láctico de varias formas de realización de la invención bajo condiciones de fermentación en el medio de sales minerales NBS.

Las figuras 3A-3B ilustran la capacidad de la betaína para aumentar la tolerancia al ácido y al azúcar durante la producción de ácido láctico mediante una forma de realización de la invención.

Las figuras 4A-4B ilustran la capacidad de una forma de realización de la invención para aclimatarse a los medios minerales.

Las figuras 5A-5G ilustran el progreso de la producción de ácido láctico por otra forma de realización de la invención bajo varias condiciones de fermentación.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID nº: 1 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para deleción de frdBC. SEQ ID nº: 2 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para deleción de frdBC. SEQ ID nº: 3 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para deleción de adhE. SEQ ID nº: 4 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido... [Seguir leyendo]

1. Cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende las siguientes modificaciones genéticas para la cepa de E. coli KO11 (ATCC 55124) : a) inserción del gen casAB de Klebsiella oxytoca detrás del codón de terminación de lacY; b) integración del gen celY de Erwinia chr y santhemi en el gen frdA; c) inactivación o deleción de focA-Z. mobilis pdc-adhBpflB; d) inactivación o deleción del gen de alcohol deshidrogenasa de E. coli nativa; y e) inactivación o deleción del gen de acetato-quinasa (ackA) .

2. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 1, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada comprende además genes de resistencia antibiótica inactivados o eliminados.

3. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 1, donde el gen casAB de Klebsiella oxytoca y el gen celY de Erwinia chr y santhemi se inactivan o eliminan en dicha cepa de E. coli genéticamente modificada después de la inserción.

4. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 2, donde el gen casAB de Klebsiella oxytoca y el gen celY de Erwinia chr y santhemi se inactivan o eliminan en dicha cepa de E. coli genéticamente modificada después de la inserción.

5. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 2, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente para crecimiento y producción de ácido láctico mejorados.

6. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 3, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente para crecimiento y producción de ácido láctico mejorados.

7. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 4, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente para crecimiento y producción de ácido láctico mejorados.

8. Cepa de E. coli genéticamente modificada según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7, donde los genes antibióticos se eliminan con recombinasa FLP.

9. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 7, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es SZ186 (NRRL B-30862) .

10. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 5, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es SZ132 (NRRL B-30861) .

11. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 1, 2, 3, 4 o 5, donde el gen mgsA de dicha cepa se inactiva o elimina en dicha cepa de E. coli genéticamente modificada.

12. Cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende la cepa de E. coli SZ194 (NRRL B30863) en la que el gen mgsA se ha inactivado o eliminado.

13. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 12, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente para crecimiento y producción de ácido láctico mejorados.

14. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 13, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es TG112 (NRRL B-30926) , TG113 (NRRL B-30927) o TG114 (NRRL B-30928) .

15. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 11 o 12, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada comprende además un gen nativo ldhA inactivado o eliminado y un gen heterólogo insertado recombinante que codifica una lactato deshidrogenasa L-específica.

16. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 15, donde dicho gen de lactato dehidrogenasa Lespecífica heterólogo es un gen ldhL (por ejemplo, un gen ldhL obtenido de P. acidilactici) .

17. Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, donde dicha cepa se desarrolla metabólicamente para crecimiento y producción de ácido láctico mejorados.

18. Cepa de E. coli genéticamente modificada seleccionada del grupo que consiste en: SZ132 (NRRL B-30861) ; SZ186 (NRRL B- 30862) ; SZ194 (NRRL B-30863) ; TG103 (NRRL B-30864) ; TG102 (NRRL B-30921) ; TG105 (NRRL B-30922) ; TG106 (NRRL B-30923) ; TG107 (NRRL B-30924) ; TG108 (NRRL B-30925) ; TG112 (NRRL B-30926) ; TG113 (NRRL B30927) ; TG114 (NRRL B-30928) ; TG128 (NRRL B-30962) ; TG129 (NRRL B-30963) ; y TG130 (NRRL B-30964) .

19. Método de cultivo o de desarrollo de una cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende la inoculación de un medio de cultivo con una o más cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 y cultivo de dicha cepa de E. coli genéticamente modificada.

20. Método para producir D- (-) -lactato o ácido D- (-) -láctico que comprende el cultivo de una o más cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 bajo condiciones que permitan la producción de ácido D- (-) -láctico y opcionalmente neutralizar el ácido D- (-) -láctico para formar D- (-) -lactato.

21. Método según la reivindicación 20, donde dicha cepa o cepas de E. coli genéticamente modificadas se seleccionan de TG112 (NRRL B-30926) , TG113 (NRRL B-30927) , TG114 (NRRL B-30928) o SZ194 (NRRL B-30863) .

22. Método para producir L- (+) -lactato o ácido L- (+) -láctico que comprende el cultivo de una o más cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 o 17 bajo condiciones que permitan la producción de ácido L- (+) -láctico y opcionalmente neutralizar el ácido L- (+) -láctico para formar L- (+) -lactato.

23. Método según la reivindicación 22, donde dicha cepa o cepas de E. coli genéticamente modificadas son TG103 (NRRL B- 30864) , TG105 (NRRL B-30922) , TG106 (NRRL B-30923) , TG107 (NRRL B-30924) , o TG108 (NRRL B30925) .

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19, 20, 21, 22 o 23, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se cultiva en uno o más medios de sales minerales.

25. Método según la reivindicación 24, donde el medio de sales minerales comprende entre 2% y 20% (p/v) de un azúcar.

26. Método según la reivindicación 25, donde el medio de sales minerales contiene 2%, 2, 5%, 3%, 3, 5%, 4%, 4, 5%, 5%, 5, 5%, 6%, 6, 5%, 7%, 7, 5%, 8%, 8, 5%, 9%, 9, 5%, 10%, 10, 5%, 11%, 11, 5%, 12%, 12, 5%, 13%, 13, 5%, 14%, 14, 5%, 15%, 15, 5%, 16%, 16, 5%, 17%, 17, 5%, 18%, 18, 5%, 19%, 19, 5% o 20% (p/v) de un azúcar.

27. Método según la reivindicación 25 o 26, donde el azúcar es glucosa o sacarosa o una combinación de glucosa y sacarosa.

28. Método según la reivindicación 20, donde una cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 11 se cultiva bajo condiciones que permitan la producción de D- (-) -lactato o ácido D- (-) -láctico quiralmente puro.

29. Método según la reivindicación 22, donde una cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 15, 16 o 17 se cultiva bajo condiciones que permitan la producción de L- (+) -lactato o ácido L- (+) -láctico quiralmente puro.

30. Método según la reivindicación 21, donde dicho método produce D- (-) -lactato o ácido D- (-) -láctico quiralmente puro.

31. Método según la reivindicación 23, donde dicho método produce L- (+) -lactato o ácido L- (+) -láctico quiralmente puro.

32. Método según la reivindicación 28, 29, 30 o 31, que comprende además el paso de purificación del lactato quiralmente puro.

33. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32, donde el lactato se produce a concentraciones de al menos 0, 5M.

34. Método según la reivindicación 33, donde el medio de cultivo es un medio de sales minerales químicamente definido

o medio de sales minerales NBS.

35. Método según la reivindicación 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34, donde el rendimiento de ácido láctico es de al menos 90%.

36. Método según la reivindicación 36, donde el rendimiento es de al menos 90%, 90, 5%, 91%, 91, 5%, 92%, 92, 5%, 93%, 93, 5%, 94%, 94, 5%, 95%, 95, 5%, 96%, 96, 5%, 97%, 97, 5%, 98%, 98, 5% o 99%.

37. Método según la reivindicación 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36, donde no hay contaminación detectable de una forma estereoisomérica de ácido láctico o lactato con la otra forma estereoisomérica o la pureza quiral del estereoisómero específico es de al menos 99, 9%.

38. Composición que comprende una o más cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 y medio de crecimiento.