Marcadores tumorales.

Un método para detectar cáncer en un sujeto mamífero detectando la respuesta inmune de dicho mamífero a proteínas marcadoras de tumor en circulación o células tumorales que expresan dichas proteínas marcadoras de tumor,

comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra de fluidos corporales de dicho mamífero con un panel de dos o más antígenos marcadores de tumor distintos obtenidos de diferentes proteínas;

(b) determinar la presencia o ausencia de complejos de dichos antígenos marcadores de tumor unidos a autoanticuerpos presentes en dicha muestra de fluidos corporales, siendo dichos anticuerpos inmunológicamente específicos para dichas proteínas marcadoras de tumor;

mediante lo cual la presencia de dichos complejos es indicativa de la respuesta inmune a proteínas marcadoras de tumor en circulación o células tumorales que expresan dichas proteínas marcadoras de tumor; y

(c) donde los resultados obtenidos con los antígenos marcadores de tumor en el panel se usan en combinación.

Marcadores tumorales La invención se refiere a métodos para detectar o medir cuantitativamente la respuesta inmune de un mamífero a marcadores tumorales en circulación o marcadores tumorales expresados sobre la superficie de células tumorales, también a kits para realizar los métodos y al uso de estos métodos en la detección de cáncer, en el control del progreso de cáncer, en la detección de enfermedad recurrente en pacientes con cáncer que han experimentado previamente tratamiento anti-cáncer.

El desarrollo y progresión de cáncer en un paciente generalmente se encuentra asociado a la presencia de marcadores en el fluido corporal del paciente, reflejando estos “marcadores tumorales” diferentes aspectos de la biología del cáncer (véase, Fateh-Maghadam, A. & Steilber, P. (1993) Sensible use of tumour markers. Publicado por Verlag GMBH, ISBN 3-926725-07-9) . A menudo se encuentra que los marcadores tumorales son formas alteradas de las proteínas de tipo silvestre expresadas por células “normales”, en cuyo caso la alteración puede ser un cambio en la secuencia de aminoácidos primaria, un cambio en la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria o un cambio en la modificación post-traduccional, por ejemplo, glicosilación anormal. Como alternativa, las proteínas de tipo silvestre que se regulan positivamente o sobre-expresan en células tumorales, posiblemente como resultado de amplificación génica o regulación transcripcional anormal, también pueden ser marcadores tumorales.

Los ensayos establecidos para marcadores tumorales presentes en fluidos corporales tienden a centrarse en la detección de marcadores tumorales que reflejan una masa tumoral y como tales son de valor muy tarde en el proceso de enfermedad, por ejemplo, en el diagnostico de enfermedad metastásica. Los marcadores más ampliamente usados incluyen antígeno carcinoembrionario (CEA) y la glicoproteína llamada CA 15.3, ambas cuales han sido útiles principalmente como indicadores de enfermedad sistémica principal y de recaída después de terapia (Molina, R., Zanon, G., Filella, X. et al. Use of serial carcinoembr y onic antigen and CA 15.3 assays in detecting relapses in breast cancer patients. (1995) Breast Cancer Res Treat 36: 41-48) . Estos marcadores son de uso limitado más pronto en la progresión de enfermedad, por ejemplo, en la exploración de pacientes asintomáticos. Por tanto, en la búsqueda de marcadores tumorales presentes en fluido corporal que sean de uso pronto en el proceso de enfermedad, la presente invención ha buscado identificar marcadores que no dependan de la masa tumoral per se.

Las diferencias entre una proteína de tipo silvestre expresada por células “normales” y una proteína marcadora de tumor correspondiente pueden, en algunos casos, conducir a que la proteína marcadora de tumor se reconozca por 35 el sistema inmune de un individuo como “no propia” y por tanto provoque una respuesta inmune en ese individuo. Esto puede ser una respuesta inmune humoral (es decir, media por células B) que conduce a la producción de autoanticuerpos inmunológicamente específicos para la proteína marcadora de tumor. Los autoanticuerpos son anticuerpos de origen natural dirigidos contra un antígeno que el sistema inmune de un individuo reconoce como extraña incluso si ese antígeno realmente está originado en el individuo. Pueden estar presentes en la circulación como autoanticuerpos libres en circulación o en forma de complejos inmunes en circulación que constan de autoanticuerpos unidos a su proteína marcadora de tumor diana.

Como alternativa a la medida directa o detección de proteína marcadora de tumor en fluidos corporales, podrían desarrollarse ensayos para medir la respuesta inmune del individuo a la presencia de una proteína marcadora de 45 tumor en términos de producción de autoanticuerpos. Dichos ensayos constituirían esencialmente detección indirecta de la presencia de la proteína marcadora de tumor. A causa de la naturaleza de la respuesta inmune, es probable que los autoanticuerpos puedan provocarse por una cantidad muy pequeña de proteína marcadora de tumor en circulación y métodos indirectos que dependen de la detección de la respuesta inmune a marcadores tumorales serán por consiguiente más sensibles que métodos para la medida directa de marcadores tumorales en 50 fluidos corporales. Los métodos de ensayo basados en la detección de autoanticuerpos pueden, por lo tanto, ser de particular valor pronto en el proceso de enfermedad y posiblemente también en relación a la exploración de pacientes asintomáticos, por ejemplo, para identificar individuos “en riesgo” de desarrollar enfermedad.

Las proteínas marcadoras de tumor que se ha observado que provocan autoanticuerpos en suero incluyen una clase 55 particular de proteína p53 mutante, descrita en la patente de Estados Unidos Nº 5.652.115, que puede definirse por su capacidad de unirse a la proteína de choque térmico de 70kd (hsp70) . Los autoanticuerpos contra p53 pueden detectarse en pacientes con varias afecciones benignas y malignas diferentes (descritas en el documento US 5.652.115) pero están en cada caso presentes en sólo un subconjunto de pacientes. Por ejemplo, un estudio que utiliza un ensayo ELISA para la detección de autoanticuerpos dirigidos contra la proteína p53 en el suero de 60 pacientes con cáncer de mama informó de que se produjeron autoanticuerpos contra p53 por un 26% de los pacientes y un 1, 3% de sujetos de control (Mudenda, B., Green, J. A., Green, B. et al. The relationship between serum p53 autoantiboidies and characteristics of human breast cancer. (1994) Br J Cancer 69: 4445-4449.) . Una segunda proteína marcadora de tumor que se sabe que provoca autoanticuerpos en suero es la mucina epitelial MUC1 (Hinoda, Y. et al. (1993) Immunol Lett. 35: 163-168; Kotera, Y. et al. (1994) Cancer Res. 54: 2856-2860) .

En la mayoría de los cánceres provocados por una acumulación progresiva de alteraciones genéticas, tales como cáncer de mama, la presencia de marcadores tumorales en fluidos corporales refleja el desarrollo y progresión de enfermedad pero ningún marcador único por sí mismo incluye todos los parámetros clínicamente importantes. Por ejemplo, las características de un marcador útil para el diagnóstico de cáncer pueden ser bastante diferentes de marcadores que proporcionan información acerca del pronóstico. Además, en cada situación clínica (es decir, diagnóstico o pronóstico) pueden ser necesarios diferentes marcadores cuando se trata con cáncer primario y cáncer secundario (metastático) y puede necesitarse un marcador diferente otra vez para proporcionar un método para medir la eficacia de un transcurso de tratamiento particular. Por lo tanto, las diferentes situaciones clínicas necesitan diferentes marcadores biológicos y, como se ha observado con p53, no todos los pacientes expresan el mismo conjunto de proteínas marcadoras de tumor. Por lo tanto, es difícil prever que uno cualquiera de los marcadores tumorales únicos sea universalmente aplicable a todos los pacientes en todas las fases de enfermedad.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un sistema de ensayo mejorado para la detección de marcadores tumorales presentes en los fluidos corporales que generalmente es más útil en todos los pacientes y en una diversidad de situaciones clínicas diferentes.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona un método para detectar cáncer en un sujeto mamífero detectando la respuesta inmune de dicho mamífero a proteínas marcadoras de tumor en circulación o células tumorales que expresan dichas proteínas marcadoras de tumor, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra de fluidos corporales de dicho mamífero con un panel de dos o más antígenos marcadores de tumor distintos obtenidos de diferentes proteínas;

(b) determinar la presencia o ausencia de complejos de dichos antígenos marcadores de tumor unidos a autoanticuerpos presentes en dicha muestra de fluidos corporales, siendo dichos autoanticuerpos

inmunológicamente específicos para dichas proteínas marcadoras de tumor mediante lo cual, la presencia de dichos complejos es indicativa de la respuesta inmune a proteínas marcadoras de tumor en circulación o células tumorales que expresan dichas proteínas marcadoras de tumor; y

(c) donde los resultados obtenidos con los antígenos marcadores de tumor en el panel se usan en combinación.

El método de la invención, que puede mencionarse a continuación en este documento como “ensayo de panel”, utiliza un panel de dos o más antígenos marcadores de tumor para controlar la respuesta inmune... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar cáncer en un sujeto mamífero detectando la respuesta inmune de dicho mamífero a proteínas marcadoras de tumor en circulación o células tumorales que expresan dichas proteínas marcadoras de 5 tumor, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra de fluidos corporales de dicho mamífero con un panel de dos o más antígenos marcadores de tumor distintos obtenidos de diferentes proteínas;

(b) determinar la presencia o ausencia de complejos de dichos antígenos marcadores de tumor unidos a autoanticuerpos presentes en dicha muestra de fluidos corporales, siendo dichos anticuerpos inmunológicamente específicos para dichas proteínas marcadoras de tumor; mediante lo cual la presencia de dichos complejos es indicativa de la respuesta inmune a proteínas marcadoras de tumor en circulación o células tumorales que expresan dichas proteínas marcadoras de tumor; y

(c) donde los resultados obtenidos con los antígenos marcadores de tumor en el panel se usan en combinación. 15

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos uno de dichos dos o más antígenos marcadores de tumor está marcado con una proteína o péptido final.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que al menos uno de dichos antígenos marcadores de tumor está marcado con biotina.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos uno de dichos dos o más antígenos marcadores de tumor se seleccionan entre MUC1, p53, c-erbB2, Ras, c-myc, BRCA1, BRCA2, PSA, APC

o CA125. 25

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que los autoanticuerpos detectados son indicativos de cáncer, preferiblemente cáncer de mama, vejiga, colorrectal, próstata u ovario.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5, en el que dicho panel comprende al menos p53 y c-erbB2.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el cáncer es cáncer de vejiga y el panel incluye también MUC1 y c-myc.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el cáncer es cáncer colorrectal y el panel también incluye Ras y/o APC.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el cáncer es cáncer de próstata y el panel también incluye PSA y/o BRCA1.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el cáncer es cáncer de mama y el panel incluye MUC-1 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el cáncer es cáncer de ovario y el panel también incluye 45 BRCA1 y/o CA125.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el cáncer es cáncer colorrectal y el panel se selecciona entre los siguientes:

p53 y Ras opcionalmente con c-erbB2 y/o APC, p53 y APC opcionalmente con c-erbB2 y/o Ras, o Ras y APC opcionalmente con p53 y/o c-erbB2.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el cáncer es cáncer de próstata y el panel se selecciona 55 entre los siguientes:

p53 y PSA opcionalmente con BRCA1 y/o c-erbB2, o c-erbB2 y PSA opcionalmente con p53 y/o BRCA1.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el cáncer es cáncer de ovario y el panel se selecciona entre los siguientes:

p53 y CA125 opcionalmente con c-erbB2 y/o BRCA1, o c-erbB2 y CA125 opcionalmente con p53 y/o BRCA1.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el cáncer es cáncer de mama y el panel se selecciona 65 entre los siguientes:

p53 y MUC1 con c-erbB2 y/o c-myc, y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA opcionales, p53 y c-myc con c-erbB2 y/o MUC1 y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA opcionales, p53 y BRCA1 con c-erbB2 y/o MUC1 y/o c-myc y/o BRCA2 y/o PSA opcionales,

p53 y BRCA2 con c-erbB2 y/o MUC1 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o PSA opcionales, c-erbB2 y MUC1 con p53 y/o c-myc, y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA opcionales, c-erbB2 y c-myc con p53 y/o MUC1 y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA opcionales, c-erbB2 y BRCA1 con p53 y/o MUC1 y/o c-myc y/o BRCA2 y/o PSA opcionales, o c-erbB2 y BRCA2 con p53 y/o MUC1 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o PSA opcionales.

16. Un kit de ensayo adecuado para realizar el método de ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo dicho kit de ensayo un panel de dos o más antígenos marcadores de tumor distintos y un medio para poner en contacto dicho panel con una muestra de fluidos corporales.

17. El uso método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la detección de cáncer de mama, vejiga, colorrectal, próstata u ovario.

18. Un método para detectar enfermedad recurrente en un paciente previamente diagnosticado como portador de células tumorales, habiendo experimentado dicho paciente tratamiento para reducir la cantidad de células tumorales detectando la respuesta inmune de dicho mamífero a proteínas marcadoras de tumor en circulación o células tumorales que expresan dichas proteínas marcadoras de tumor, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra de fluidos corporales de dicho mamífero con un panel de dos o más antígenos marcadores de tumor distintos obtenidos de diferentes proteínas;

(b) determinar la presencia o ausencia de complejos de dichos antígenos marcadores de tumor unidos a autoanticuerpos presentes en dicha muestra de fluidos corporales, siendo dichos anticuerpos inmunológicamente específicos para dichas proteínas marcadoras de tumor; mediante lo cual la presencia de dichos complejos es indicativa de la respuesta inmune a proteínas marcadoras de tumor en circulación o células tumorales que expresan dichas proteínas marcadoras de tumor; y

(c) donde los resultados obtenidos con los antígenos marcadores de tumor en el panel se usan en combinación.

19. Un método para identificar aquellos individuos que están en riesgo aumentado de desarrollar cáncer en una población de individuos asintomáticos detectando la respuesta inmune de dicho mamífero a proteínas marcadoras de tumor en circulación o células tumorales que expresan dichas proteínas marcadoras de tumor, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra de fluidos corporales de dicho mamífero con un panel de dos o más antígenos marcadores de tumor distintos obtenidos de diferentes proteínas;

(b) determinar la presencia o ausencia de complejos de dichos antígenos marcadores de tumor unidos a autoanticuerpos presentes en dicha muestra de fluidos corporales, siendo dichos anticuerpos inmunológicamente específicos para dichas proteínas marcadoras de tumor; mediante lo cual la presencia de dichos complejos es indicativa de la respuesta inmune a proteínas marcadoras de tumor en circulación o células tumorales que expresan dichas proteínas marcadoras de tumor; y

(c) donde los resultados obtenidos con los antígenos marcadores de tumor en el panel se usan en combinación.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en que aquellos individuos están en riesgo aumentado de desarrollar cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer colorrectal o cáncer de ovario. 50

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso en la determinación del perfil de marcadores tumorales de un individuo que padece cáncer.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dicho perfil de marcadores tumorales se determina 55 secuencialmente en dicho individuo como una indicación del transcurso de enfermedad.