Manipulación del metabolismo de nitrógeno usando transportador de amonio o glucosa6-fosfato deshidrogenasas o farnesil fosfato sintetasas (FPP).

Un proceso para la asimilación, acumulación y/o utilización potenciada de nitrógeno y el contenido incrementado de nitrógeno total y la eficiencia incrementadas en el uso de nitrógeno (NUE) definida como el rendimiento en biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo,

incluyendo nitrógeno de fertilizantes en organismos fotosintéticos activos, el cual comprende, incrementar o generar en un organismo o en una parte o en un compartimiento del mismo la expresión de al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de:

a) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se muestra en SEQ ID NO: 690 o un fragmento del mismo con una actividad de proteína de transporte de amonio, la cual confiere una asimilación, acumulación y/o utilización potenciada de nitrógeno y contenido de nitrógeno total incrementado y eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno,

b) una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico como la mostrada en SEQ ID NO: 689 la cual confiere asimilación, acumulación y/o utilización potenciadas de nitrógeno y contenido incrementado de nitrógeno total y eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno;

c) molécula de ácido nucleico cuya secuencia puede ser deducida a partir de una secuencia de polipéptidos codificada por una molécula de ácido nucleico (a) o (b) como resultado de la degeneración del código genético y que confiere asimilación, acumulación y/o utilización potenciada de nitrógeno y contenido incrementado de nitrógeno total y eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno;

d) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de proteína de transporte de amonio que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de (a) a (c) y la cual confiere la asimilación, acumulación y/o utilización incrementadas de nitrógeno y contenido incrementado de nitrógeno total y eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno.

Manipulación del metabolismo de nitrógeno usando transportador de amonio o glucosa 6-fosfato deshidrogenasas o farnesil fosfato sintetasas (FPP) .

La presente invención se relaciona con la manipulación del metabolismo del nitrógeno en organismos fotosintéticos activos, preferiblemente en plantas. En particular, la presente invención se relaciona con un proceso para la asimilación, acumulación y/o utilización mejorada de nitrógeno y/o para el contenido incrementado de nitrógeno total y la eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno (NUE) , definida como el rendimiento de biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo, incluyendo fertilizantes de nitrógeno en un organismo fotosintético activo.

La asimilación en la nutrición de las plantas es esencial para el crecimiento y desarrollo de las plantas y por lo tanto también para la cantidad y calidad de los producto vegetales. Debido a la fuerte influencia de la eficiencia en la utilización de la nutrición sobre el rendimiento de las plantas y la calidad del producto, se vierte una gran cantidad de fertilizante en los campos para optimizar el crecimiento y calidad de las plantas. La productividad de las plantas ordinariamente está limitada por tres nutrientes primarios, fósforo, potasio y nitrógeno, el cual es usualmente el elemento limitante en proporción en el crecimiento de las plantas de estos tres. Por lo tanto, el elemento nutricional principal requerido para el crecimiento de las plantas es el nitrógeno (N) . Es un constituyente de numerosos compuestos importantes encontrados en las células vivas, incluyendo los aminoácidos, proteínas (enzimas) , ácidos nucléicos y clorofila. Del 1.5% al 2% del material seco de la planta es nitrógeno y aproximadamente el 16% de la proteína total de las plantas. Así, la disponibilidad del nitrógeno es un factor limitante principal para el crecimiento y producción de los cultivos vegetales (Frink et al., 1999) , y tiene también un impacto principal en la acumulación de proteínas y en la composición de los aminoácidos.

Las plantas pueden utilizar un amplio rango de especies de nitrógeno incluyendo amoníaco volátil (NH3) , óxidos de nitrógeno (NOx) , nitrógeno mineral, como nitratos (NO3-) y sales de amonio (NH4+) , urea y derivados de urea, y nitrógeno orgánico (aminoácidos, péptidos, etc.) . Algunas plantas son capaces de utilizar el nitrógeno atmosférico mediante bacterias simbióticas o ciertos hongos. Sin embargo, en la mayor parte de los suelos agrícolas, el nitrato (NO3-) es la fuente más importante de nitrógeno (Crawford and Glass, 1998; Hirsch and Sussman, 1999) . No obstante el amonio NH4+ juega también un papel importante probablemente subestimado, porque la mayor parte de las plantas preferencialmente toman NH4+ cuando ambas formas están presentes - incluso si NH4+ está presente a concentraciones más bajas que NO3- (Von Wiren et al., 2000) .

Debido a los altos requerimientos de nitrógeno para las plantas de cultivo, la fertilización con nitrógeno es una inversión agrícola mundial principal, con 80 millones de toneladas métricas de fertilizantes de nitrógeno aplicadas anualmente (como nitrato y/o amonio) (Frink et al., 1999) . Hay también consecuencias ambientales negativas por el uso extensivo de fertilizantes que contienen nitrógeno en la producción de cultivos porque los cultivos agrícolas solamente retienen aproximadamente dos tercios del nitrógeno aplicado. Por lo tanto aplicaciones altas de fertilizante son seguidas por escapes altos por filtración, pérdidas gaseosas y eliminación de cultivos. El nitrógeno no absorbido puede fugarse subsecuentemente hacia el suelo y contaminar los suministros de agua (Frink et al., 1999) . Debido a las altas pérdidas por filtración del nitrógeno desde los ecosistemas agrícolas a las aguas subterráneas y aguas superficiales, el nitrógeno es reconocido actualmente como un contaminante importante. La fuga de nitrógeno, a saber cómo nitrato desde las tierras agrícolas, afecta la calidad del agua para bebida y produce eutroficación de lagos y áreas costeras. El uso abundante de fertilizantes que contienen nitrógeno puede llevar adicionalmente al deterioro final de la calidad del suelo, a la polución ambiental y a riesgos para la salud.

Debido a los altos costes de los fertilizantes de nitrógeno para la producción agrícola, y adicionalmente por su efecto nocivo sobre el ambiente, es deseable desarrollar estrategias para reducir la aplicación de nitrógeno y/o para optimizar la asimilación, acumulación y/o utilización del nitrógeno para una disponibilidad dada de nitrógeno mientras que simultáneamente se mantenga una productividad óptima y la calidad de los organismos fotosintéticos activos, preferiblemente plantas cultivadas, por ejemplo cultivos. Preferiblemente, las plantas cultivadas utilizadas como alimento y/o forraje deberían tener una calidad mejorada, especialmente en términos de acumulación y composición de sus proteínas.

Para una asimilación, acumulación y utilización eficiente del consumo de nitrógeno, se requieren procesos complejos asociados con la absorción, traslocalización, asimilación y redistribución del nitrógeno para operar con eficiencia. Las diferencias en la absorción y utilización del nitrógeno entre genotipos han sido demostradas para varias especies por diferentes investigadores (Chang & Robinson, 2001) . Se ha reportado evidencia considerable sobre las diferencias genotípicas en el consumo de nitrógeno, por ejemplo en su acumulación para el maíz y la canola (Weisler et al., 2001; Gallais & Hirel, 2004) .

El consumo de nitrógeno en las plantas está altamente regulado y coordinado con otras rutas de transporte y metabólicas (Crawford, 1995) , y un cierto número de genes relacionados con el consumo y asimilación de nitratos han sido identificados y caracterizados (Forde, 2002) . Las plantas absorben el nitrato a través de transportadores localizados en la membrana de plasma celular epidérmica y cortical de las raíces a lo largo de un amplio rango de concentración de nitratos utilizando diferentes mecanismos de transporte, incluyendo sistemas de transporte de alta afinidad constitutivos e inducibles por nitrato, así como transportadores de baja afinidad inducibles por nitrato (Stitt, 1999) . Una vez en el citoplasma de la célula de la raíz, el nitrato puede ser almacenado en las vacuolas para uso posterior, transportado hacia el xilema y traslocalizado hacia el brote para asimilación y/o almacenamiento, liberado de regreso a la rizosfera o reducido a nitrito y luego a amoniaco a través del nitrato reductasa (NR) y las nitrito reductasa (NiR) . La reducción del nitrato a nitrito y luego a amoníaco genera nitrógeno en una forma que puede ser asimilada en aminoácidos a través de la ruta GOGAT (Stitt, 1999) . Con el fin de ser incorporado en los aminoácidos, ácidos nucléicos, y otros compuestos, el NO-3 debe ser reducido a NH+4. La NR (nitrato reductasa) es la primera enzima en el proceso de reducción del NO-3 a la forma amino. Es una enzima inducible por el sustrato y se cree que es la etapa más limitante en la asimilación del nitrógeno.

La rata in situ de la reducción del NO-3 es controlada primariamente por la rata de consumo de NO-3, más que por cualquier alteración en la actividad de la nitrato reductasa (NRA) o limitaciones en el poder reductor. Así, el consumo de NO-3 parece ser de importancia primaria en la asimilación de nitrógeno en plantas alimentadas con NO-3. La variación genética en NRA está bien documentada en varias especies. La NRA está afectada por factores tales como condiciones ambientales y etapa de desarrollo de la planta, así como la parte de la planta, tal como raíces y parte superior. Adicionalmente, pruebas in vivo e in vitro usualmente dan resultados diferentes. Resultados variables fueron encontrados por varios investigadores en sus esfuerzos para relacionar la NRA al rendimiento de granos y de efectos relacionados con N tales como N total reducido en las plantas, contenido de nitrógeno en granos, concentración de nitrógeno en los granos e índice de recolección de nitrógeno.

Con el fin de describir la eficiencia de la ruta completa del nitrógeno, comenzando con la toma desde el suelo, asimilación, acumulación y finalmente utilización del nitrógeno para el crecimiento hasta la madurez y para la maduración de frutos y semillas, se conocen diferentes metodologías. A la luz de la importancia de la adquisición y utilización óptima del nitrógeno, se han seguido diferentes estrategias para las optimizaciones en las plantas.

La Patente de los Estados Unidos 6, 727, 411 divulga un método para producir tomates transgénicos que tienen un contenido de aminoácidos libres incrementado... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para la asimilación, acumulación y/o utilización potenciada de nitrógeno y el contenido incrementado de nitrógeno total y la eficiencia incrementadas en el uso de nitrógeno (NUE) definida como el rendimiento en biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo, incluyendo nitrógeno de fertilizantes en organismos fotosintéticos activos, el cual comprende, incrementar o generar en un organismo o en una parte o en un compartimiento del mismo la expresión de al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de:

a) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se muestra en SEQ ID NO: 690 o un fragmento del mismo con una actividad de proteína de transporte de amonio, la cual confiere una asimilación, acumulación y/o utilización potenciada de nitrógeno y contenido de nitrógeno total incrementado y eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno,

b) una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico como la mostrada en SEQ ID NO: 689 la cual confiere asimilación, acumulación y/o utilización potenciadas de nitrógeno y contenido incrementado de nitrógeno total y eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno;

c) molécula de ácido nucleico cuya secuencia puede ser deducida a partir de una secuencia de polipéptidos codificada por una molécula de ácido nucleico (a) o (b) como resultado de la degeneración del código genético y que confiere asimilación, acumulación y/o utilización potenciada de nitrógeno y contenido incrementado de nitrógeno total y eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno;

d) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de proteína de transporte de amonio que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de (a) a (c) y la cual confiere la asimilación, acumulación y/o utilización incrementadas de nitrógeno y contenido incrementado de nitrógeno total y eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno.

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la molécula de ácido nucleico se origina a partir de un microorganismo.

3. Método para la identificación de un producto genético que confiere asimilación, acumulación y/o utilización incrementadas de nitrógeno y contenido incrementado de nitrógeno total y eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno (NUE) definida como el rendimiento en biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo, incluyendo fertilizantes de nitrógeno, en un organismos fotosintético o parte del mismo que comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto las moléculas de ácido nucleico de una muestra, la cual contiene un gen candidato que codifica un producto genético que confiere asimilación, acumulación y/o utilización potenciadas de nitrógeno y contenido incrementado de nitrógeno total en un organismo fotosintético o parte del mismo después de la expresión con la molécula de acido nucleico tal como se define en la reivindicación 1;

b) identificar las moléculas de ácido nucleico, que hibridan bajo condiciones restrictivas relajadas con la molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 a) – c) ;

c) introducir las moléculas de ácido nucleico candidatas en células anfitrionas apropiadas para asimilación, acumulación y/o utilización potenciadas de nitrógeno y para contenido incrementado de nitrógeno y eficiencia incrementadas en el uso de nitrógeno (NUE) , definida como el rendimiento en biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo, incluyendo nitrógeno de fertilizantes,

d) expresar las moléculas de ácido nucleico identificadas en las células anfitrionas;

e) probar la asimilación, acumulación y/o utilización de nitrógeno y el contenido incrementado de nitrógeno total y la eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno (NUE) , definida como el rendimiento en biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo, incluyendo fertilizantes de nitrógeno; y

f) identificar la molécula de ácido nucleico y su producto genético cuya expresión confiere una asimilación, acumulación y/o utilización incrementadas de nitrógeno y un contenido incrementado de nitrógeno total y una eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno (NUE) , definida como el rendimiento en biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo, incluyendo fertilizantes de nitrógeno, en la célula anfitriona y en la célula anfitriona después de la expresión en comparación con el tipo silvestre.

4. Un método para la identificación de un producto genético que confiere asimilación, acumulación y/o utilización potenciadas de nitrógeno y contenido incrementado de nitrógeno total y eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno (NUE) , definido como el rendimiento en biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo, incluyendo fertilizantes de nitrógeno, en un organismo fotosintético o en una parte del mismo que comprende las siguientes etapas:

a) identificar en un banco de datos moléculas de ácido nucleico de un organismo; las cuales pueden tener un gen candidato que codifique un producto genético que confiere una asimilación, acumulación y/o utilización potenciadas de nitrógeno y un contenido incrementado de nitrógeno total en un organismo fotosintético o una parte del mismo después de la expresión, y el cual puede ser 20% homólogo con la molécula de ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 1a) – c) ;

b) introducir las moléculas de ácido nucleico candidatas en células anfitrionas apropiadas para asimilación, acumulación y/o utilización potenciadas de nitrógeno y contenido incrementado de nitrógeno total y eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno (NUE) , definida como el rendimiento en biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo, incluyendo fertilizantes de nitrógeno,

c) expresar las moléculas de ácido nucleico identificadas en las células anfitrionas;

d) probar la asimilación, acumulación y/o utilización de nitrógeno y el contenido incrementado de nitrógeno total y la eficiencia incrementada del uso de nitrógeno (NUE) , definida como el rendimiento en biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo, incluyendo fertilizantes de nitrógeno; y

e) identificar la molécula de ácido nucleico y su producto genético cuya expresión confiere una asimilación, acumulación y/o utilización incrementadas de nitrógeno y un contenido incrementado de nitrógeno total y una eficiencia incrementada en el uso de nitrógeno (NUE) , definida como el rendimiento en biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo, incluyendo fertilizantes de nitrógeno, en la célula anfitriona y en la célula anfitriona después de la expresión en comparación con el tipo silvestre.

5. Uso de la molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 para la identificación de una molécula de ácido nucleico que confiere una asimilación, acumulación y/o utilización incrementadas de nitrógeno y un contenido incrementado de nitrógeno total y una eficiencia incrementada en el uso del nitrógeno (NUE) , definida como el rendimiento en biomasa por unidad de nitrógeno disponible en el suelo, incluyendo fertilizantes de nitrógeno, en la célula anfitriona después de la expresión en comparación con el tipo silvestre.

6. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado por un rendimiento total potenciado como se define en la reivindicación 1.

7. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado por el rendimiento potenciado de plantas tal como se define en la reivindicación 1 bajo condiciones limitantes de nitrógeno.

8. Uso de la molécula de ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 1 para obtener un rendimiento total potenciado en biomasa, preferiblemente en semillas o rendimiento en masa proteínica.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 para obtener un rendimiento potenciado tal como se define en la reivindicación 1 bajo condiciones limitadas de nitrógeno.