LPS con un lípido A incluyendo un número reducido de cadenas acilo secundarias por molécula de LPS en comparación con la molécula correspondiente de LPS no modificada y conteniendo al menos una cadena acilo secundaria ligada a una cadena acilo primaria en el extremo reductor del disacárido de glucosamina.

LPS de toxicidad reducida obtenido a partir de bacterias Gram negativas modificadas genéticamente.

Antecedentes de la invención

La presente invención se incluye en el campo de las vacunas y más específicamente provee nuevos compuestos que pueden ser usados en forma de adyuvantes en vacunas. Muchos adyuvantes han sido descritos por ejemplo emulsiones de aceite mineral tipo Freund, sales de aluminio, saponinas, muramil dipéptido y derivados MPL, MF59 etc. No obstante, en realidad sólo algunos están autorizados para su uso en seres humanos. Esto se debe generalmente a una proporción desfavorable entre una acción inmunoestimuladora versus la toxicidad. Una referencia general relativa a los adyuvantes puede ser encontrada en The Theory and Practical Application of Adjuvants (D.E.S. Stewart-Tull ed. John Wiley & Sons 1995) y la información está incorporada aquí como referencia. La técnica anterior expone también varios organismos cuyo tratamiento enzimático de LPS puede producir una toxicidad reducida. Los LPS ilustrados que han sido sometidos a este tratamiento son: Salmonella typhimurium y Salmonella minnesota. También se ha sugerido que las siguientes los presentan: todas las bacterias Gram negativas y específicamente Salmonella, Escherichia, Haemophilus, Moraxella, Campylobacter y Neisseria. No obstante, no se han provisto detalles en referencia a una prueba de la actividad adyuvante.

Fijándonos más detalladamente en esta técnica anterior se constata que Munford et al (en la patente US 4,929,604 publicada en 1990) exponen un LPS S typhimurium donde el 95% de los grupos acilo secundarios ha sido eliminado por medio de un tratamiento enzimático. El tratamiento Munford no puede eliminar específicamente las cadenas de acilo secundarias asegurando sólo una desacilación parcial. El método Munford no puede proporcionar un producto uniforme y en el mejor de los casos casi todos los grupos acilo secundarios serán eliminados.

Éstos sugieren que una actividad adyuvante puede estar presente debido a una prueba de mitogenicidad en las células B. La prueba de mitogenicidad en las células B es sin embargo una prueba fiable para indicar la actividad adyuvante. Probablemente tal producto no exhiba una actividad adyuvante. El método Munford en realidad muestra sólo la eliminación de las cadenas acilo secundarias del extremo no reductor del LIDS. El producto resultante no contiene ningún grupo acilo secundario en el extremo reductor del LPS. El producto Munford presenta una carencia de cadenas laterales secundarias del miristoilo y lauroilo. El método Munford no puede eliminar específicamente sólo miristoilo o sólo lauroilo. El método Munford no puede eliminar solamente una cadena de acilo secundaria de una ubicación especifica. El método Munford está previsto para ser aplicado también a Escherichia, Haemophilus y Neisseria.

Éstos muestran un LPS de Salmonella con un grupo fosfato sobre el extremo no reductor y otro sobre el extremo reductor. El LPS de Salmonella posee 1 grupo miristoilo y 1 lauroilo sobre el extremo no reductor. El LPS de Salmonella no posee ningún grupo acilo secundario sobre el extremo reductor.

Myers et al en la patente US 4,912,094 utilizan una hidrólisis alcalina en condiciones controladas para eliminar únicamente el residuo acilo beta-hidroximirístico que está ligado por éster a la glucosamina del extremo reductor en la posición 3. Asimismo se describe un producto donde una de las cadenas acilo primarias ha sido eliminada químicamente. No se ha mencionado nada respecto a la eliminación de la cadena acilo secundaria. El producto resultante está considerado menos tóxico y mantiene propiedades antigénicas. Esto se establece simplemente en base a la mitogenicidad reducida de MPL A (ácido hidrolizado) con respecto a la proliferación en las células B para la versión desacetilada. No obstante, la prueba de mitogenicidad en las células B no es una prueba fiable para indicar una actividad adyuvante. La Echerichia coli y el LPS de Salmonella minnesota están proporcionados como ejemplos. No obstante, sólo los datos de la actividad biológica están proporcionados para el LPS de Salmonella minnesota. Éstos sugieren que el método deba ser aplicado a todos los LPS pero no ofrecen soporte de los mismos.

El mismo tema está citado en un artículo de Erwin et al con Munford como coautor (1991). Según el resumen del mismo articulo de Erwin, el texto siguiente está comentado en el resumen "Estos estudios indican que la contribución de las cadenas acilo secundarias en las bioactividades de un LPS dado no puede ser prevista de manera segura a partir de las relaciones de estructura-actividad expuesta del lípido A o del comportamiento de otro LPS desacilado".

Los genes implicados en la aciloxiacilación del lípido A son conocidos en la técnica. Recientemente dos aciltransferasas de funcionamiento tardío de biosíntesis del lípido A en Escherichia coli fueron identificadas como los productos de los genes htrB y msbB (Clementz et al., 1996,1997); el gen hrtB fue descrito previamente según se requería para el crecimiento en medios ricos por encima de 33ºC, y el gen msbB como un supresor multicopia de htrB. En la reacción óptima, el HtrB transfiere laurato al (KDO)2-Lípido IVA, después de lo cual el MsbB puede añadir miristato para completar la acilación del lípido A (Fig. 1). Los productos predominantes formados por los mutantes htrB y msbB son especies tetra- y penta-acilo, respectivamente. Los genes presentan el 27,5% de identidad; un tercer gen perteneciente a esta familia está presente también en el cromosoma de E. coli, pero su función en la biosíntesis del lípido A todavía debe ser demostrada.

WO9725061 expone mutantes de las bacterias Gram negativas 1 pxF (msbB) que carecen de la fracción del ácido mirístico del lípido A en forma de huéspedes para la producción de inmunogenes o proteínas heterólogas. Hones et al., 1998, J. Hum. Virol. 1: 251-256 muestran que el LPS aislado de los mutantes HtrB y MsbB de E. coli mantiene la capacidad de inducir una secreción de beta-quimiocina sin la activación concomitante de citoquinas pirogénicas.

La secuencia del genoma de Haemophilus influenzae contiene ambos homólogos htrB y msbB; la mutación de htrB está asociada a una modificación de la fosforilación y de la acilación del LPS (Lee et al., 1995), sugiriendo un efecto pleiotrópico de la pérdida de las cadenas aciloxiacilo de cecoración de la cadena oligosacárida. Una mutación knock-out en el gen htrB cíe H. influenzae exponía una reducción de la toxicidad asociada al LPS (Nichols et al., 1997).

Apicella (también autor del documento citado de Lee et al) et al describen también un mutante knock-out htrB en WO97/19688. Estos describen un mutante tetraacilo de H. influenzae obtenido a través de una mutación de htrB, dicho LPS del mutante presentando supuestamente una toxicidad sustancialmente reducida aún con antigenicidad retenida.

Éstos utilizaron una homología de la secuencia de htrB de E coli para encontrar una secuencia similar de Haemophilus. Esta secuencia similar tenía el 56% de identidad y era un 73% similar a la secuencia de htrB de E. coli. Unos mutantes de H. influenzae fueron producidos y crecidos. Un análisis del LPS del mutante de Haemophilus reveló una reducción de fosfoetanolaminas, 50% menos con dos en el núcleo interno. Una especie como un lípido A mono o difosforilo pentaacilo de H. influenzae desprovisto de una de las cadenas acilo secundarias (p. ej. fracción de ácido mirisitico) en aproximadamente un 10% es también revelada por Apicella. Además se ilustró un tetraacilo presente en aproximadamente un 90%. Por ello, el método Apicella produce una mezcla de estructuras de LPS de H. influenzae recombinante donde la mayor parte del producto no contiene cadenas acilo secundarias. Unos ensayos bactericidas de preparaciones LOS son provistas por Apicella en forma de inmunizaciones de crías de ratas y de chinchilla usando la cepa mutante de H. influenzae. En las pruebas se utiliza LPS per se como inmunógeno, éstas no ilustran o sugieren nada con respecto a una actividad adyuvante. La respuesta inmunológica contra el LPS per se está expuesta en las pruebas de Apicella et al.

Un mutante de Salmonella...

1. LPS con un lípido A incluyendo un número reducido de cadenas acilo secundarias por molécula de LPS en comparación con la molécula correspondiente de LPS no modificada y conteniendo al menos una cadena acilo secundaria ligada a una cadena acilo primaria en el extremo reductor del disacárido de glucosamina.

2. LPS según la reivindicación 1, donde el lípido A tiene el mismo número de cadenas acilo primarias que la molécula de LPS no modificada.

3. LPS según las reivindicaciones 1 o 2, donde el lípido A tiene una cadena acilo secundaria en la cadena acilo primaria en la posición 2 de la glucosamina en el extremo reductor del disacárido de glucosamina.

4. LPS según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la cadena acilo secundaria es una cadena de lauroilo.

5. LPS según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, con un lípido A que posee una fosfoetanolamina ligada a un grupo fosfato en el extremo reductor.

6. LPS según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, con un lípido A que tiene la estructura molecular

7. Composición comprendiendo LPS tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Composición según las reivindicaciones 7, comprendiendo un antígeno añadido al LPS.

9. Método para la producción de LPS tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, dicho método comprende el cultivo de una bacteria de los géneros Neisseria o Bordotella, mediante el cual la bacteria comprende una mutación que elimina la expresión de un gen que posee más del 60% de homología con la secuencia codificante del gen htrB1 de la figura 2.

10. Método según la reivindicación 9, donde la bacteria pertenece a las especies Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoae.

11. Método según la reivindicación 9 o 10, donde la bacteria es una cepa H44/76 de Neisseria meningitidis y donde el gen tiene la secuencia codificante de la figura 2.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 comprendiendo además el aislamiento y la purificación del LPS.