Intercambio de nucleótidos seleccionados mejorado con oligonucleótidos modificados con ANB.

Un procedimiento para la altered& seleccionada de una secuencia de ADN aceptor bicatenario quecomprende la combinación de la secuencia de ADN aceptor bicatenario con un oligonucleotido donador en presenciade proteinas que sean susceptibles de intercambio de nucleotidos seleccionados,

en el que la secuencia de ADNaceptor bicatenario contiene una primera secuencia de ADN y una segunda secuencia de ADN que es elcomplemento de la primera secuencia de ADN y en el que el oligonucleotido donador comprende un dominio quocomprende al menos una discrepancia con respecto a la secuencia de ADN aceptor bicatenario que ha de seralterada, preferentemente con respecto a la primera secuencia de ADN, y en el quo el nucleatido on la discrepanciano este modificado, en el que el oligonucleatido contiene mas de un AND, en el que cada ANB este situado a unadistancia de al menos un nucleotido con respecto a la discrepancia, y en el que el oligonucleatido comprende unasección que contiene dos ANB situados simetricamente alrededor de la discrepancia a una distancia de unnucleotido con respecto a la discrepancia, en el que el procedimiento no es para el tratamiento del cuerpo humano oel cuerpo animal mediante cirugia o terapia, y en el quo el procedimiento no es para la alteración seleccionada delADN on seres humanos.

Inlercambio de nucleólidos seleccionados mejorado con oligonucleótidos modificados con ANB.

Campo de la invención La presente invención versa acerca de un procedimienlo para la alleración específica y selectiva de una secuencia de nucleólidos en un sitio especifico del ADN en una célula diana mediante la introducción de un oligonucleótido en esa célula. El resultado es el intercambio seleccionado de uno o mas nucleótidos para que la secuencia del ADN diana se convierta en la del oligonucleótido cuando sean diferentes. Más en particular, la invención versa acerca del intercambio de nucle6lidos seleccionados usando oligonucleótidos modificados. La invención también versa acerca de la aplicación del procedimiento.

Antecedentes de la invención La modificación genética es el procedimienlo de creación deliberada de cambios en el material genético de células vivas con el propósito de modificar o una mas propiedades biológicas codificadas genéticamente de esa célula, o del organismo del cual forma parte la célula o en el cual puede regenerarse. Estos cambios pueden adoptar la forma de una deleción de partes del material genético, una adición de material genético exógeno o cambios en la secuencia de nucleótidos existente del material genético. Se conocen procedimientos para la modiflC8ción genética de organismos eucariotas hace más de 20 años y han encontrado una aplicación generalizada en células vegetales, humanas y animales y en microorganismos para mejoras en los campos de la agricultura, la salud humana, la calidad de los alimentos y la protección medioambiental. Los procedimientos comunes de modificación genética consisten en anadir fragmentos de ADN exógeno al genoma de una célula, que entonces conferirá una nueva propiedad a esa célula o a su organismo sobre y por encima de las propiedades codificadas por genes ya existentes (incluyendo aplicaciones en las que la expresión de los genes existentes será suprimida por ello) . Aunque muchos de tales ejemplos son efectivos en la obtención de las propiedades deseadas, eslos procedimientos, no obstante, no son muy precisos, porque no hay ningún control sobre las posiciones genómicas en las que se insertan los fragmentos de ADN exógeno (y, por ende, sobre los niveles definitivos de expresión) , y porque el efecto deseado tendrá que manifestarse sobre las propiedades naturales codifICadas por el genoma original y bien equilibrado. Por el contrario, procedimientos de modificación genética que den como resultado la adición, la deleción o la conversión de nucleótidos en loei genómicos predefinidos permitirán la modificación precisa de genes existentes.

El intercambio de nucleótidos seleccionados dirigido por oligonucleótidos (TNE, a veces ODTNE) es un procedimiento que se basa en el suministro al núcleo de la célula eucariota de oligonucleótidos sintéticos (moléculas consistentes en tramos cortos de reslos de tipo nucleótido que se asemejan al ADN en sus propiedades de apareamiento de bases de Watson-Crick, pero que pueden ser qulmicamente diferentes del ADN) (Alexeev y Yoon, Nature Biotechnol. 16: 1343, 1998; Rice, Nature Biotechnol. 19: 321, 2001; Kmiec, J. Clin. Inves\. 112: 632, 2003) . Diseftando deliberadamente un nucleótido discrepante en la secuencia de homologla del oligonucleótido, el nucleótido discrepante puede ser incorporado en la secuencia genómica de ADN. Este procedimiento permite la conversión de nucleótidos aislados o, como mucho, de algunos nucleótidos en loci existentes, pero puede ser aplicado para crear codones finalizadores en genes existentes, dando como resultado una aReración de su función,

o crear cambios en los codones, dando como resultado genes que codifican protelnas con una composición alterada de aminoácidos (ingenieria de proteínas) .

El intercambio de nucleótidos seleccionados (TNE) ha sido descrilo en células vegetales, animales y de levadura. Los primeros informes sobre TNE utilizaban lo que se denominaba quimera, que consistia en un oligonucleótido autocomplementario que está disenado para intercalarse en el sitio de la diana cromosómica. La quimera contiene un nucleólido discrepante que forma la plantilla para introducir la mutación en la diana cromosómica. Para seleccionar eventos de TNE, la mayoria de los estudios intenten introducir un cambio de un solo nucleótido en un gen endógeno que conduce a la resistencia a herbicidas. Los primeros ejemplos que usaban quimeras procedían de células humanas (véase la resena: Rice y otros, Na!. Biotech. 19: 321-326) . El uso de quimeras también ha tenido éxito en las especies vegetales tabaco, arroz y maiz (Beelham y otros, 1999 Proc. Natl. Acad. Sc!. USA 96: 87748778; Kochevenko y otros, 2003 Plant Phys. 132: 174-184; Okuzaki y otros, 2004 Plant Cel! Rep. 22: 509-512) . Sin embargo, se descubrió que la actividad de las quimeras era dificil de reproducir y, por ello, se ha sometido a ensayo la actividad del TNE de oligonucíeótidos monoca\enarios (mc) . Se ha descubierto que estos dan resultados más reproducibles en células de trigo, de levadura y humanas (Liu y otros, 2002 Nuc. Acids Res. 30: 2742-2750; resena, parekh-Olmedo y otros, 2005 Gene Therapy 12: 639-646; Dong y otros, 2006 Plant Cell Rep. 25: 457-65) .

Varios grupos han demostrado que también puede detectarse el TNE usando extractos de proteina total celular. Tales ensayos de búsqueda de actividad de TNE se denominan ensayos libres de células (Cole-Strauss y otros, 1999 Nucleic Acids Res. 27: 1323-1330; Gamper y otros, 2000 Nucleic Acids Res. 28, 4332-4339; Kmiec y otros, 2001 Plant J. 27: 267-274; Rice y otros, 2001 40: 857-868) . El ensayo se configura como sigue. Se muta un plásmido que contiene dos genes bacterianos de resistencia a los antibióticos (kanamicina y carbenicilina) para que uno de los genes de resistencia a los antibióticos (por ejemplo, kanamicina) contenga un codón finalizador dentro del marco de lectura debido a la aReración de un solo nucleótido (por ejemplo, TAT a TAG) . A continuación se incuba este plasmido mutado con proteina total celular y un oligonucleótido monocalenario diseftado para corregir el codón finalizador en el gen de resistencia a los antibióticos. Las proteinas necesarias para el TNE están presentes en el extracto celular y utilizan el oligonucleótido para alterar el codón finalizador en el gen de resistencia a los antibióticos, restaurando el fenotipo de resistencia. A continuación se purifica el ADN plasmidlco a partir de la mezcla de reacción y se transforma en E. coli. Acto seguido, las bacterias son cuHivadas en placas sobre medios que contienen kanamicina, y el número de colonias bacterianas representa el número de eventos de reparación de TNE. Se calcula la eficacia de la electroporación contando el número de colonias que se desarrollan en medios que contienen carbenicilina. La eficacia del TNE puede ser cuantificada calculando la proporción de plásmidos reparados COn respecto al número total de plásmidos transformados.

En un experimento de este tipo, el oligonucleótido efectúa una sustitución, alterando TAG a TAC. Además, el sistema libre de células también puede usarse para estudiar la posibilidad de usar oligonucleótidos para producir inserciones de nucleótidos individuales. Pueden producirse plásmidos que tengan delecionado un único nucleótido del gen de resistencia a los antibióticos, generando una mutación del marco de lectura. En el ensayo libre de células, se repara la deleción mediante la adición de un nucleótido mediado por el 0ligonucleótido.

El mayor problema afrontado por la aplicación del TNE en células de organismos superiores como las plantas es la poca eficacia que se ha documentado hasta ahora. En el malz, Zhu y otros, (2000 Nature Biotech. 18: 555-558) documentaron una frecuencia de conversión de 1 • 10.... Estudios posteriores en el tabaco (Kochevenko y otros, 2003 Plant Phys. 132: 174-184) y el arroz (Okuzaki y otros, 2004 Plant Cell Rep. 22: 509-512) han documentado frecuencias de 1 • 10" Y 1 • 10""', respectivamente. Estas frecuencias siguen siendo demasiado bajas para la aplicación práctica del TNE.

La replicación fiel de ADN es uno de los criterios clave que media el mantenimiento de la estabilidad genómica y garantiza que la información genética contenida en el ADN se transmite libre de mutación de una generación a la siguiente. Surgen muchos errores de la lesión a la cadena de ADN parental o son generados por agentes que reaccionan con bases de ADN (luz UV, toxinas medioambientales) . Todo organismo debe mantener una salvaguardia para evitar o corregir estas mutaciones. Se cree que el sistema de reparación de discrepancias (MRM) reconoce y conrige bases discrepantes o no pareadas causadas durante la replicación del... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la a~eración seleccionada de una secuencia de ADN aceptor bicatenario que comprende la combinación de la secuencia de ADN aceptor bicatenario con un oligonucleótido donador en presencia de proteínas que sean susceptibles de intercambio de nucleótidos seleccionados, en el que la secuencia de ADN aceptor bicatenario contiene una primera secuencia de ADN y una sagunda secuencia de ADN que es el complemento de la primera secuencia de ADN y en el que el oligonucleótido donador comprende un dominio que comprende al menos una discrepancia con respecto a la secuencia de ADN aceptor bicatenario que ha de ser alterada, preferentemente con respecto a la primera secuencia de ADN, y en el que el nucleótido en la discrepancia no está modificado, en el que el oligonucleótido contiene más de un ANB, en el que cada ANB está situado a una distancia de al menos un nucleótido con respecto a la discrepancia, y en el que el oligonucleótido comprende una sección que contiene dos ANB situados simétricamente alrededor de la discrepancia a una distancia de un nucleótido con respecto a la discrepancia, en el que el procedimiento no es para el tratamiento del cuerpo humano o el cuerpo animal mediante cirugía o terapia, y en el que el procedimiento no es para la alteración seleccionada del ADN en seres humanos.

2. El procedimiento según la reivindicación 1 en el que al menos el 50% de los nucleótidos del oligonucleótido son derivados de ANB.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 en el que, en el oligonucleótido 2, y no más, nucleótidos son ANB.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el oligonucleótido tiene una longitud entre 10 Y 500 nucleótidos.

5. El prOcedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la alteración está dentro de una célula seleccionada preferentemente del grupo constituido por una célula vagetal, una célula fúngica, una célula de roedor, una célula de primate, una célula humana o una célula de levadura.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en el que las proteínas están derivadas de un extracto celular.

7. El procedimiento según la reivindicación 6 en el que el extracto celular se selecciona del grupo constituido por un extracto de células vegetales, un extracto de células fúngicas, un extracto de células de roedor, un extracto de células de primate, un extracto de células humanas o un extracto de células de levadura.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en el que la alteración es una deleción, una sustitución o una inserción de al menos un nucleótido.

9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el ADN diana procede de hongos, bacterias, plantas, mamlferos o seres humanos.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el ADN bicatenario procede de ADN genómico, ADN lineal, cromosomas artificiales de mamlfero, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales vagetales, ADN crom0s6mico nuclear, ADN cromosómico de orgánulos o ADN episomático.

11. El procedimiento sagún una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para a~erar una célula, corragir una mutación mediante la restauración a la forma natural, inducir una mutación, desactivar una enzima mediante alteración de la ragión codificante, modificar la bioactividad de una enzima alterando la región codificante o modificar una proteina alterando la región codiflcante.

12. El uso de un oligonucleótido según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, para a~erar una célula, corragir una mutación mediante la restauración a la forma natural, inductr una mutación, desactivar una enzima mediante alteración de la ragión codificante, modificar la bioactividad de una enzima alterando la regián codificante, modificar una protelna alterando la región cOdificante, reparar discrepancias, la alteración seleccionada de material genético (vegetal) , incluyendo mutación de genes, reparación de genes seleccionados y bloqueo de genes, en el que el uso no es para el tratamiento del cuerpo humano o el cuerpo animal mediante cirugla O terapia, y en el que el uso no es para la alteración seleccionada del ADN en seres humanos.

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