Inhibidores de la BTK para uso en el tratamiento de tumores epiteliales resistentes a fármacos quimioterapéuticos.

Una proteína aislada de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2, que codifica una isoforma de la proteína BTK

Inhibidores de la BTK para uso en el tratamiento de tumores epiteliales resistentes a fármacos quimioterapéuticos

Campo de la técnica [0001] La presente invención se refiere a una proteína aislada de acuerdo con las características indicadas en el preámbulo de la reivindicación principal. También está destinada a un procedimiento in vitro para reducir la resistencia a los fármacos en las células tumorales epiteliales así como en las células madre tumorales.

Antecedentes de la tecnología [0002] Una de las estrategias más seguidas en la terapia de las enfermedades neoplásicas prevé el uso de fármacos (quimioterapia) capaces de dañar el ADN de las células tumorales con el fin de inducir el proceso natural

de la apoptosis en las mismas.

No obstante, se sabe que las células tumorales pueden responder de un modo inesperado a la terapia farmacológica, lo que muestra, por el contrario, una fuerte resistencia a la misma. También se sabe que una de las razones principales de la resistencia farmacológica mostrada por las células tumorales es la incapacidad de las células para comenzar el proceso de la apoptosis, incluso en presencia de daños considerables en el ADN.

Este fenómeno se ha rastreado hasta una alteración funcional (mutación o deleción) del gen p53, que ya no puede iniciar el proceso de apoptosis celular, de modo que hace que las células resistan la acción del fármaco. Los niveles de resistencia a los fármacos de las células tumorales pueden ser muy altos. Por ejemplo, en el caso de las células tumorales del colon-recto en fase avanzada, una terapia farmacológica a base de 5-fluorouracilo (5FU) muestra una respuesta eficaz en únicamente el 10-15% de las células y una combinación de 5FU con fármacos nuevos, tales como irinotecán y oxaliplatino, conduce a un incremento de la mortalidad celular de hasta un 40-50%, un valor que sigue siendo completamente insatisfactorio para una acción terapéutica eficaz contra enfermedades neoplásicas.

En Clinical Cancer Research vol. 8 (2002) p. 1224-1233, Uckun F.M. y col. demostraron la actividad quimiosensibilizadora de LFM A 13 dirigido a la BTK en células de leucemia.

Los resultados mostrados en Biorganic & Medicinal Chemistr y vol. 15 (2007) p. 800-814 de Uckun F.M. y

col. indican que LFM A13 es un inhibidor de proteínas quinasas que tiene un efecto antiproliferativo sobre las células de cáncer de mama humano y células de glioblastoma.

El documento WO 02/38797 notifica la secuencia de nucleótidos (nº de registro en Genbank X58957) y la secuencia de aminoácidos (nº de registro en Genbank CAA41728) de la BTK humana.

En los últimos años se ha descubierto un fenómeno celular denominado "interferencia del ARN” (ARNi) por medio del cual se silencia la expresión génica de un modo específico. Aprovechando dicho proceso, es posible obtener la silenciación selectiva de los genes con una función desconocida, de modo que permite la definición de su función específica a través del estudio del fenotipo obtenido. Aplicando técnicas de ARNi y estudiando los resultados 45 fenotípicos, es además posible asignar nuevas funciones a los genes ya conocidos.

Hoy en día, los genes implicados en el fenómeno de resistencia a los fármacos de las células tumorales se desconocen en su gran mayoría.

Por tanto, existe una gran necesidad de identificar nuevos genes implicados en la resistencia a fármacos y de diseñar procedimientos y compuestos capaces de disminuir sustancialmente la resistencia de las células tumorales a fármacos.

Descripción de la invención 55 [0011] El problema subyacente a la presente invención es el de disponer de compuestos capaces de reducir la resistencia a los fármacos de las células tumorales de tipo epitelial, con el fin de permitir la fabricación de medicamentos destinados a la terapia de enfermedades neoplásicas relacionadas.

La invención se refiere a una proteína aislada de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 que codifica una isoforma de la proteína BTK y el polinucleótido aislado que codifica la misma, teniendo dicho polinucleótido aislado la secuencia del primer exón correspondiente a la SEC ID Nº 1.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento in vitro de acuerdo con la 65 reivindicación 4 y el kit farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 7.

Breve descripción de las figuras [0014] Las características y ventajas de la invención estarán más claras a partir de la siguiente descripción detallada de las pruebas y resultados que han conducido a su definición, indicada con referencia al conjunto de figuras en el que:

- La Figura 1 es un gráfico que ilustra los resultados de la inhibición de la capacidad para formar colonias de células tumorales resistentes a fármacos del colon tratado con los compuestos de acuerdo con la invención y un fármaco quimioterapéutico.

- Las Figuras 2a y 2b son gráficos que muestran los resultados de un análisis de inversión de la resistencia de una línea de células tumorales a dos fármacos quimioterapéuticos diferentes por medio de la silenciación de las isoformas alfa y beta del gen GSK3,

- Las Figuras 3a - 3c son gráficos que ilustran los resultados de las pruebas de inversión de la resistencia a un

fármaco quimioterapéutico diferente de tres líneas de células tumorales diferentes del colon por medio de la 15 silenciación del gen GSK3beta,

- La Figura 4a es un gráfico que ilustra los resultados de las pruebas de inversión de la resistencia a un fármaco quimioterapéutico diferente de dos líneas de células tumorales diferentes del colon por medio de la silenciación del gen GSK3beta,

- La Figura 4b es un gráfico que ilustra los resultados de un análisis de inversión de la resistencia de una línea de células tumorales a la combinación de dos fármacos quimioterapéuticos diferentes por medio de la silenciación de la isoforma beta del gen GSK3,

- La Figura 5 es un conjunto de imágenes que ilustran la localización del citocromo C para la muerte celular inducida por 5FU en ausencia de GSK3.

- La Figura 6 es un gráfico que ilustra los resultados de los ensayos de activación de la caspasa 3 y la caspasa 7

en respuesta al tratamiento con 5FU de células de carcinoma de colon HCT116p53KO con silenciación de los genes HCT116 y GSK3alfa, GSK3beta,

- La Figura 7 es un conjunto de imágenes que ilustran la translocación de AIF al núcleo durante la muerte celular inducida por 5FU en ausencia de GSK3,

- La Figura 8 es un gráfico que ilustra la inversión de la resistencia a un fármaco quimioterapéutico de una línea de células tumorales llevada a cabo mediante el bloqueo funcional del gen de la BTK obtenido con procedimientos diferentes,

- La Figura 9 es un gráfico que ilustra el porcentaje de muerte celular inducida por 5FU sobre la sobreexpresión de BTK en células de carcinoma de colon HCT116,

-Las Figuras 10a y 10b son gráficos que ilustran la inversión de la resistencia a fármacos quimioterapéuticos por 35 medio del bloqueo funcional del gen de la BTK en diferentes líneas celulares tumorales de colon,

- La Figura 11 es un análisis de transferencia de tipo Western que muestra la expresión de BTK en varias líneas de células tumorales derivadas de diferentes cánceres epiteliales,

- Las Figuras 12a y 12b son gráficos que ilustran la inversión de la resistencia a fármacos quimioterapéuticos por medio del bloqueo funcional del gen de la BTK en diferentes líneas celulares tumorales de colon,

- La Figura 13 es un conjunto de imágenes que ilustran la acumulación en el citoplasma del citocromo C en células tratadas con 5FU sobre la inhibición de BTK,

- La Figura 14 es un gráfico que ilustra los resultados de los ensayos fluorimétricos de activación de la caspasa tras 72 horas y 96 horas en células de carcinoma de colon HCT116 y HCT116p53K0 tratadas con 5FU, inhibición de BTK o la combinación de ambos,

-La Figura 15a es una imagen de la transferencia de tipo Western que muestra que el anticuerpo sc-1696 reconoce específicamente la proteína BTK y que en las células de carcinoma epitelial (HCT116p53KO) la BTK tiene un peso molecular aparente de ∼67 kDa y que la misma forma de la proteína está presente, junto con la forma de 77 kDa “clásica”, también en células de leucemia (Nalm6) ,

- La Figura 15b es una imagen de la transferencia de tipo Western – inmunoprecipitación que confirma que también un anticuerpo diferente (BL7) identifica la proteína BTK como de ∼67 kDa en células HCT116p53KO y que esta isoforma... [Seguir leyendo]

1. Una proteína aislada de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2, que codifica una isoforma de la proteína BTK.

2. Un polinucleótido aislado que codifica la proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 1.

3. El polinucleótido de la reivindicación 2, que tiene la secuencia del primer exón correspondiente a la SEC ID Nº 1.

4. Un procedimiento in vitro para reducir la resistencia a los fármacos de las células tumorales de tipo epitelial que 10 comprende la etapa de bloquear de forma funcional y selectiva un gen de la BTK mediante:

a. una molécula de oligonucleótido de ARN de interferencia pequeño (siARN) ; o

b. LFM-A13, en el que el gen de BTK codifica una isoforma de la proteína que tiene un peso molecular entre 65 y

kDa de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 15

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dichas células tumorales son células madre.

6. El compuesto capaz de bloquear funcionalmente el gen de la BTK para uso en la disminución de la resistencia a

fármacos quimioterapéuticos en el tratamiento terapéutico de las enfermedades tumorales epiteliales, en el que 20 dicho compuesto es una molécula de oligonucleótidos de ARN de interferencia pequeño (siARN) o LEM-A13.

7. El kit farmacéutico que comprende una molécula de oligonucleótido de ARN de interferencia pequeño (siARN) o LFM-A13 capaz de bloquear de forma funcional y selectiva un gen de BTK, y un fármaco quimioterapéutico elegido del grupo que consiste en 5-fluorouracilo, oxaliplatino u oxaliplatino en mezcla con 5-fluorouracilo, en el que dicho kit

es para uso en el tratamiento de enfermedades tumorales epiteliales.

8. El kit farmacéutico para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que las enfermedades tumorales epiteliales se eligen del grupo consistente en tumores de colon, de mama, de pulmón y de ovarios.