Inhibidor recombinante de tipo Kunitz.

Ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID nº:1.

Inhibidor recombinante de tipo Kunitz.

La presente solicitud describe el procedimiento de obtención de una proteína recombinante con actividad inhibidora del factor X activado de la coagulación sanguínea; caracterizado como un inhibidor de tipo Kunitz, obtenido a partir de una biblioteca de ADN de las glándulas salivales de la garrapata Amblyomma cajennense; el procedimiento de obtención de la secuencia de oligonucleótidos clónica y la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante, el procedimiento de determinación de la actividad inhibidora de dicha proteína recombinante sobre el factor X activado, el procedimiento de determinación de la actividad anticoagulante en el plasma, el procedimiento de determinación de la actividad apoptósica en linajes de células tumorales, el procedimiento de determinación de la actividad antimetastásica en un tumor de melanoma, el procedimiento de determinación de la actividad anticancerosa (melanoma, colon, mama, pulmón y leucemia) , in vitro e in vivo.

Antecedentes de la invención Los inhibidores de las proteinasas son moléculas que actúan en los mecanismos normales de control de la actividad enzimática proteolítica y están relacionados con muchos procesos fisiológicos, como la coagulación, la fibrinólisis, la digestión, y también con procesos patológicos como el cáncer, los trastornos hemorrágicos, la inflamación y las alteraciones del equilibrio de la presión arterial (DECLERCK e IMREM, 1994) .

Uno de los medios más eficientes para controlar la coagulación es la acción de los inhibidores de las proteinasas. Los estudios han demostrado que las glándulas salivales de la mayoría de las especies hematófagas, como las garrapatas, segregan diversas sustancias anticoagulantes con el fin de hacer la sangre más fluida y de este modo optimizar su ingesta de la misma. (RIBEIRO, 1995) .

Los inhibidores del factor X activado (FXa) tienen un gran interés clínico, ya que a través de la inhibición del FXa (en el complejo protrombinasa) es posible controlar la activación de la protrombina a trombina, evitándose la formación de coágulos.

La inhibición de las proteasas se desencadena tan pronto como se inicia el proceso de coagulación. El “inhibidor de la via del factor tisular” (TFPI) es el inhibidor principal de la vía extrínseca y se ha clasificado como un miembro del grupo de los inhibidores de la familia Kunitz del BPTI (inhibidor de la tripsina pancreática bovina) (Broze, 1998) .

El TFPI humano es una proteína compuesta por tres dominios de tipo Kunitz (K1, K2 y K3) , y el K1, el primer dominio, tiene una región ácida en su parte aminoterminal, donde está situado el sitio de unión al factor VIIa. En el segundo dominio podemos encontrar la parte responsable de la unión del FXa y, finalmente, el tercer dominio presenta una región básica en su parte carboxiterminal cuya función aún no se ha determinado, pero que probablemente contiene un sitio de unión a la heparina (Rao, 1995) .

El mecanismo de inhibición del TFPI humano comprende dos fases. En la primera fase, el inhibidor se asocia a los factores FXa y FVIIa, aunque la inhibición tiene lugar propiamente en la siguiente fase, en la que se observa la formación de un complejo cuaternario con presencia de factor tisular (TF) , FXa, FVIIa y TFPI humano (TFPI: FXa:FVIIa:TF) (Sandset y Bendz, 1997) .

El inhibidor del factor tisular humano de tipo 2, “inhibidor de la vía del factor tisular - 2” (TFPI-2) , es una proteína de 32 kDa formada por tres dominios de tipo Kunitz (Chand y otros, 2004) . El TFPI-2 inhibe una serie de serina proteasas implicadas en la coagulación y la fibrinólisis, probablemente debido al residuo de arginina que se encuentra en la posición 24 (R24) del primer dominio de tipo Kunitz. En el segundo y el tercer dominios se pueden encontrar, respectivamente, residuos de glutamina y de serina. En estudios recientes se ha construido un mutante en el que el residuo de arginina se ha modificado por un residuo de glutamina (R24Q TFPI-2) , y dicha mutación da lugar al 90% de la pérdida de actividad inhibidora de la tripsina bovina. Este hecho demuestra la importancia de este residuo en el mantenimiento de la actividad inhibidora (Kamei y otros, 1999) .

Aspectos generales del desarrollo del cáncer y sus interacciones con la coagulación El riesgo de que un individuo desarrolle una neoplasia viene determinado por una combinación de diversos factores genéticos y ambientales. Por consiguiente, en el proceso de carcinogénesis, la sustancia llamada carcinógeno (de naturaleza biológica, química o física) puede actuar como iniciador o incluso promotor del proceso que se desarrolla hasta la formación de metástasis (Ruoslahti E., 1996) .

En el inicio del proceso neoplásico se producen alteraciones irreversibles en estructuras diana del ADN que contribuyen a la transformación celular. El metabolismo carcinógeno se desarrolla en dos fases llamadas fase I (activación) y fase II (destoxificación) . Algunas enzimas de fase I actúan no sólo como catalizadores de reacciones oxidativas, sino que también metabolizan grandes cantidades de sustancias carcinógenas o xenobióticos lipófilos (Bell y otros , 1993) .

La persistencia de los daños causados en el ADN depende de los mecanismos de reparación y de la supervivencia celular del tejido dañado; así, si el daño persiste o no se repara, se produce una expansión de un clon celular mutante (Duke y otros, 1996; Wainscoat y Fey, 1990) .

Es un proceso, largo muchas veces que tiene lugar en células iniciadas, que disminuye en el período de latencia y/o que aumenta la susceptibilidad a las alteraciones genéticas. Por lo general, los promotores no son genotóxicos. Son específicos de tejido y tienen múltiples mecanismos de acción que actúan en una forma epigenética que da lugar a alteraciones de la homeostasis tisular (Hermo y otros, 1987) .

Entre los mecanismos promotores se incluyen la activación de receptores de la superficie celular, la activación o inhibición de enzimas citosólicas, la activación de factores de transcripción y traducción (por las cinasas) , la estimulación de la proliferación, la inhibición de la apoptosis y la citotoxicidad directa.

En la etapa de progresión, las células tumorales también muestran capacidad para formar nuevos vasos sanguíneos que las alimenten, provocando un aumento descontrolado, ya que en un primer momento invaden los tejidos circundantes y luego pueden penetrar en el interior de un vaso sanguíneo o linfático y, a través de éstos, extenderse a otros órganos. (Meyer y otros, 1998, Matsuda y otros, 2003) .

Generalmente, las células reaccionan a diversos daños intrínsecos generados a partir de productos intermedios del metabolismo, de reacciones inflamatorias graves o crónicas y de procesos que generan metabolitos reactivos inestables de oxígeno y nitrógeno. Por otro lado, existen factores dañinos extrínsecos, como por ejemplo agentes físicos, químicos y biológicos que se eliminan por el proceso homeostático.

La última etapa (llamada progresión tumoral) incluye la invasión y la metástasis. En esta fase, las lesiones preexistentes o preneoplásicas se añaden a las alteraciones mutacionales aleatorias, incluidas la aberración de la secuencia específica, la duplicación, la deleción y/o la pérdida de heterocigosidad en genes específicos como oncogenes, genes supresores de tumores, metastogenes y genes de reparación.

Los oncogenes están inactivos en condiciones fisiológicas y se pueden activar cambiando un aminoácido o mediante la amplificación de un gen en un cromosoma que origina diversas copias de dicho gen, con el consiguiente aumento de su actividad y, finalmente, mediante la recombinación entre genes de cromosomas distintos. La diferencia de estos genes es que habitualmente están activos y atentos para evitar el crecimiento descontrolado de las células (Budillon, 1995) .

Aunque la inestabilidad genómica es la característica principal de la progresión tumoral, lo que distingue los niveles de malignidad y los convierte en cánceres mortales es la ausencia de control de la duplicación celular. Las células tumorales, así como las de un tejido normal, se duplican a través del ciclo celular (Fearon ER, 1997) .

Sin embargo, en la comprensión del ciclo celular todavía no se ha determinado por completo el mecanismo de regulación de la multiplicación celular de las células tumorales, y las características de crecimiento de los cánceres in vivo todavía no se han dilucidado.

La naturaleza invasiva de la progresión tumoral se asocia con el aumento de la movilidad de las células tumorales, con la capacidad proteolítica... [Seguir leyendo]

1. Ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID nº:1.

2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico codifica un inhibidor de tipo Kunitz del factor Xa (FXa) .

3. Polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº:3.

4. Polipéptido según la reivindicación 3, en el que el polipéptido comprende una actividad seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i) disminuir la coagulación mediada por FXa, en el que la disminución se produce en presencia de fosfolípidos;

(ii) promover la apoptosis de las células B16F10;

(iii) promover la apoptosis de las células SK-MEL-28;

(iv) disminuir la masa tumoral en un ratón C57BL/6J implantado con células tumorales B16F10;

(v) disminuir la metástasis tumoral en un ratón C57BL/6J implantado con células tumorales B16F10;

(vi) disminuir la angiogénesis en un ratón C57BL/6J implantado con células tumorales B16F10; y

(vii) aumentar la actividad fagocítica de los macrófagos en un ratón C57BL/6J implantado con células tumorales B16F10.

5. Polipéptido purificado según la reivindicación 3, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº:3.

6. Polipéptido purificado según la reivindicación 3 o 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº:2.

7. Polipéptido purificado según la reivindicación 6, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº:2.

8. Composición farmacéutica que comprende el polipéptido según la reivindicación 3 o 6.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 8, para su utilización en el tratamiento del cáncer en un individuo.

10. Polipéptido según la reivindicación 3 o 6, para su utilización en el tratamiento del cáncer en un individuo.

11. Polipéptido según la reivindicación 3 o 6, para su utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 10, en el que el tratamiento del cáncer comprende además un tratamiento quimioterápico.

12. Polipéptido según la reivindicación 3 o 6, para su utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 10, en el que el tratamiento del cáncer comprende además un tratamiento de radioterapia.

13. Polipéptido según la reivindicación 3 o 6, para su utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 10, en el que el tratamiento del cáncer está asociado con una angiogénesis tumoral disminuida en un individuo.

14. Polipéptido según la reivindicación 3 o 6, para su utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 10, para la utilización en la disminución de la progresión tumoral en un individuo.

15. Polipéptido según la reivindicación 3 o 6, para su utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 10, para la utilización en la disminución de la metástasis tumoral en un individuo.

16. Polipéptido según la reivindicación 3 o 6, para su utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 10, para la utilización en el aumento de la actividad fagocítica en un individuo.

17. Método in vitro de producción de un inhibidor de tipo Kunitz del factor Xa (FXa) , comprendiendo el método el cultivo de una célula hospedadora que comprende un vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1 en condiciones que dan como resultado la expresión del inhibidor codificado por el ácido nucleico.

18. Método según la reivindicación 17, que comprende además la purificación del inhibidor a partir de las células hospedadoras o del sobrenadante de cultivo de células hospedadoras.