Proteínas inhibidoras de una proteasa y su uso.

Una proteína recombinante inhibidora de una calicreína, que comprende una secuencia de serpina en donde el lazoP6-P6' de serpina reactivo de dicha secuencia de serpina comprende al menos un sitio activo de sustrato queconsiste en una secuencia pentapéptido seleccionada entre SSRTE,

KTRSN, ISPRS, GVFRS, GTVRS, ETKRS,LGRSL, RGRSE, RRSID, VLRSP, PFRSS, RSGSV, ARARS, SDRTA, KLRTT, RAAMM, TRAPM, DVRAA, PGRAP,VESRA, ARASE, TLQRV, RLERV, ERVSP, SSPRV, RVGPY, PSARM, RGRMA, TVRMP, LRMPT, HRMSS,RPQEL,VRPLE, SGRLA, GTLRF, QWRNS, RNDKL, MRNRA, TRDSR, TGSRD, IMSRQ, LTTSK, PFRKI específicapara dicha calicreína una quimera molecular de la misma, y/o una combinación de estas.

Proteínas inhibidoras de una proteasa y su uso

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una proteína recombinante inhibidora de una proteasa que comprende una secuencia polipeptídica inhibidora y al menos una secuencia polipeptídica de un sitio de interacción enzima-sustrato específica para una proteasa.

Otros objetivos de la invención son proporcionar una secuencia de ADN aislada y purificada que codifica la proteína recombinante inhibidora de una proteasa, un vector de expresión caracterizado porque comprende dicha secuencia de ADN aislada y purificada, una célula huésped eucariota o procariota transformada con este vector de expresión y un método para producir una proteína recombinante inhibidora.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

De todas las proteínas expresadas por los organismos vivos, las proteasas están entre las más críticas en la mediación de las rutas de la vida y la muerte celular. De hecho, las interacciones iniciales entre la proteasa y el sustrato y el posterior clivaje se encuentran en la base de un amplio espectro de eventos biológicos esenciales que incluyen trombosis, coagulación y apoptosis.

La proteólisis desregulada o el desequilibrio entre las proteasas y las antiproteasas, se ha buscado intensamente en base a la sospecha de que podría ser un factor clave en muchas patologías en que las proteasas están implicadas, tales como cáncer, enfermedades autoinmunes, inflamación y enfermedades infecciosas. Diferentes estudios realizados con agentes antiproteolíticos en modelos de cáncer y enfermedades inflamatorias (tales como artritis reumatoide y enfisema) han mostrado además un resultado interesante de mejora, fortalecimiento de la terapia antiproteolítica y el papel del equilibrio entre las proteasas y las antiproteasas.

Por ejemplo, en cáncer de próstata, que es uno de los cánceres más comunes diagnosticados en hombres americanos, se cree que las proteasas desempeñan un papel fundamental en el comportamiento maligno de las células cancerosas que incluyen un rápido crecimiento tumoral, invasión y metástasis.

La proteína calicreína glandular humana (hK2) es una serina proteasa similar a la tripsina expresada predominantemente en el epitelio prostático. Aislada primero del de plasma seminal humano, la hK2 se ha revelado recientemente como un marcador de diagnóstico para el cáncer de próstata (Deperthes y otros 1995 "aislamiento de calicreína prostática hK2, conocida además como hGK-1, en plasma seminal humano" Biochim Biophys Acta 1245, 311-6) .

Además de su papel como marcador, sus actividades proteolíticas sugieren que hK2 puede contribuir a la progresión del cáncer. Se han propuesto varias funciones posibles para esta enzima, que incluyen la activación del activador de plasminógeno de tipo uroquinasa y la inactivación del inhibidor del activador de plasminógeno-1, la activación de la pro-PSA, la degradación de la fibronectina y la degradación de la proteína de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-BP) (para revisión ver Cloutier y otros, 2004 "Development of recombinant inhibitors specific to human calicreína 2 using phasedisplay selected substrates" Eur J Biochem 3, 607-13) .

Se mostró recientemente que la calicreína hK2 puede formar un complejo específico con un inhibidor de proteasa, conocido como PI-6, en cánceres y particularmente en cáncer de próstata. Basado en el descubrimiento de este complejo específico, las patentes de Estados Unidos 6, 284, 873 y 6, 472, 143 proporcionan un método diagnóstico para determinar la presencia o ausencia de cáncer o necrosis tisular.

Al tener en cuenta su expresión específica en el tejido de próstata y la participación de todos sus posibles sustratos en el desarrollo del cáncer, la hK2 se considera además como un objetivo terapéutico (Darson y otros, 1997 "Human glandular kallikrein 2 (hK2) expression in prostatic intraepithelial neoplasia and adenocarcinoma: a novel prostate cancer marker" Urology 49, 857-62) . Por lo tanto, sería útil el desarrollo de inhibidores de proteasas específicos y duraderos y especialmente los inhibidores de calicreína.

Estos candidatos de inhibidores de proteasas se pueden seleccionar entre la familia de la serpina (inhibidores de serina proteasas) , que es una gran familia de proteínas implicadas en la regulación de procesos fisiológicos complejos. Estas proteínas de aproximadamente 45 kDa se pueden subdividir en dos grupos, uno que es inhibidor y el otro no inhibidor.

Las serpinas contienen un lazo de sitio reactivo flexible expuesto o lazo de serpina reactivo (RSL) , que está implicado en la interacción con la putativa proteinasa objetivo. Después de la unión a la enzima y el clivaje del enlace escindible P1-P1' del RSL, se forma un complejo covalente (Huntington y otros, 2000 "Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation" Nature 407, 923-6) . La formación de este complejo induce un importante reordenamiento y de ese modo atrapa irreversiblemente la proteasa objetivo. La especificidad inhibidora de las serpinas se atribuye en gran parte a la naturaleza de los residuos en las posiciones P1-P'1 y la longitud del RSL. Cambiar el dominio RSL o el sitio reactivo de las serpinas es una aproximación para entender el proceso inhibidor entre una serpina y una enzima y para desarrollar inhibidores específicos (Dufour y otros 2001 "The contribution of arginine residues within the P6-P1 region of alpha 1-antitr y psin to its reaction with furin" J Biol Chem 2 76, 38971-9 y Plotnick y otros 2002 "The effects of reactive site location on the inhibitor y properties of the serpin alpha (1) -antichymotr y psin" J Biol Chem 277, 29927-35) .

Varias serpinas tales como el inhibidor de la proteína C, a2 antiplasmina, antitrombina-III, a1-antiquimotripsina (ACT) , o el inhibidor de proteasa 6 se han identificado como los inhibidores de la hK2 (Saedi y otros, 2001 "La calicreína 2 humana (hK2) , pero no el antígeno prostático específico (PSA) , rápidamente forma complejos con el inhibidor de proteasa 6 (PI-6) liberado de las células de carcinoma de próstata " Int J Cancer 94, 558-63) . La formación relativamente lenta de complejos entre hK2 y ACT se atribuye principalmente a los residuos de Leu 358-Ser 359 en las posiciones P1-P'1 del RSL, un enlace peptídico desfavorable para esta enzima de tipo tripsina.

Hasta ahora, se han descrito solamente selecciones de nuevos inhibidores de calicreína, que inhiben específicamente la calicreína de plasma, y su uso en métodos terapéuticos y de diagnóstico (patentes US 6, 057, 287, US 6, 333, 402, US 5, 994, 125, y US 5, 795, 865) . Sin embargo, estas patentes describen la producción de inhibidores que son homólogos a los dominios Kunitz del inhibidor de la tripsina pancreática bovina, y especialmente proteínas que son homólogas a los dominios Kunitz del inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteína (LACI) , que inhiben específicamente las calicreínas de plasma.

Otro documento, concretamente US 5, 827, 662, describe un método para producir inhibidores de proteasa recombinante (variantes de antiquimotripsina) capaces de modular efectivamente la actividad de la serina proteasa. Estos inhibidores siempre comprenden una región de bisagra de un lazo de serpina reactivo (RSL) que tiene las secuencias de aminoácidos modificadas. La región de bisagra es parte del RSL y se extiende a partir de las posiciones P14 a P9.

El documento WO 95/27053, a nombre de la Universidad de Pensilvania, proporciona análogos de la alfa -1antiquimotripsina que tienen sustituciones de aminoácidos en la posición 358 o las posiciones 356-361. Estos análogos exhiben actividad inhibidora de quimasa y se usan en la preparación de medicamentos para el tratamiento de inflamación del pulmón, lesión por reperfusión o prevención de coágulos de sangre. No hay indicación de que estos análogos se pueden usar ya sea para la actividad de inhibición de la calicreína o para el tratamiento de cáncer.

Además de ser específico para calicreína del plasma, estos inhibidores son moléculas muy pequeñas y se unen a la calicreína del plasma en una manera reversible. Una de los principales inconveniente de este enfoque es que el uso de las proteínas que inhiben sus objetivos de una manera reversible tiene el riesgo de que la desunión de la proteasa restaure su actividad.

Por lo tanto, una ventaja de usar inhibidores más grandes, como se describe en la presente descripción, es que esto conduce a la formación de complejos covalentes que inhibe la proteasa objetivo de manera irreversible. Una ventaja adicional de la presente invención es que los grandes complejos covalentes se conoce que se eliminan rápidamente... [Seguir leyendo]

1. Una proteína recombinante inhibidora de una calicreína, que comprende una secuencia de serpina en donde el lazo P6-P6' de serpina reactivo de dicha secuencia de serpina comprende al menos un sitio activo de sustrato que consiste en una secuencia pentapéptido seleccionada entre SSRTE, KTRSN, ISPRS, GVFRS, GTVRS, ETKRS, LGRSL, RGRSE, RRSID, VLRSP, PFRSS, RSGSV, ARARS, SDRTA, KLRTT, RAAMM, TRAPM, DVRAA, PGRAP, VESRA, ARASE, TLQRV, RLERV, ERVSP, SSPRV, RVGPY, PSARM, RGRMA, TVRMP, LRMPT, HRMSS, RPQEL, VRPLE, SGRLA, GTLRF, QWRNS, RNDKL, MRNRA, TRDSR, TGSRD, IMSRQ, LTTSK, PFRKI específica para dicha calicreína una quimera molecular de la misma, y/o una combinación de estas.

2. La proteína recombinante inhibidora de una calicreína de la reivindicación 1, caracterizada porque la calicreína es una proteína calicreína hK2.

3. La proteína recombinante inhibidora de una calicreína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque la secuencia de serpina se selecciona del grupo que comprende la a-1antiquimotripsina (ACT) , inhibidor de la proteína C (PCI) , a-1antiproteinasa (AAT) , precursor de la proteína relacionada con la a1antitripsina humana (ATR) , inhibidor de la a-2-plasmina (AAP) , precursor de la antitrombina-III humana (ATIII) , inhibidor de proteasa 10 (PI 10) , precursor de la proteína 2 de unión a colágeno humano (CBP2) , inhibidor de proteasa 7 (PI7) , leuserpina inhibidor de proteasa 2 (HLS2) , inhibidor de la proteasa C1 de plasma humano (C1 INH) , inhibidor de la elastasa monocito/neutrófilo (M/NEI) , inhibidor del activador del plasminógeno tipo 3 (PAI3) , inhibidor de proteasa 4 (PI4) , inhibidor de proteasa 5 (PI5) , inhibidor de proteasa 12 (PI12) , inhibidor del activador del plasminógeno humano tipo 1 precursor endotelial, inhibidor del activador de plasminógeno humano tipo 2 de la placenta (PAI2) , precursor del factor derivado del epitelio pigmentado humano (PEDF) , inhibidor de proteasa 6 (PI6) , inhibidor de proteasa 8 (PI8) , inhibidor de proteasa 9 (PI9) , antígeno 1 humano asociado al carcinoma de células escamosas (SCCA-1) , antígeno 2 humano asociado al carcinoma de células escamosas (SCCA-2) , globulina de unión a T4 (TBG) , Megsin, e inhibidor de proteasa 14 (PI14) , fragmentos biológicamente activos de estos, quimeras moleculares de estos, y/o combinaciones de los mismos.

4. La proteína recombinante inhibidora de una calicreína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha proteína recombinante inhibidora de una calicreína se selecciona del grupo que comprende la sec. con núm. de ident. 2, 4, 8, 10 y 14.

5. La proteína inhibidor recombinante de una calicreína de la reivindicación 4, caracterizada porque dicha proteína recombinante inhibidora de una calicreína es la sec. con núm. de ident. 4 u 8.

6. La proteína inhibidor recombinante de una calicreína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porquela al menos una secuencia de sitio activo de sustrato específica para dicha calicreína es un péptido sustrato seleccionado por calicreína usando una genoteca pentapéptido aleatorio de exhibición de fago.

7. Una secuencia de ADN aislada y purificada que codifica la proteína recombinante inhibidora de una calicreína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. La secuencia de ADN aislada y purificada de la reivindicación 7, caracterizada porque dicha secuencia se selecciona del grupo que comprende la sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 3, sec. con núm. de ident.: 5, sec. con núm. de ident.: 7, sec. con núm. de ident.: 9, sec. con núm. de ident.: 11 y sec. con núm. de ident.: 13.

9. Un vector de expresión caracterizado porque, comprende la secuencia de ADN aislada y purificada de las reivindicaciones 7 u 8.

10. El vector de expresión de la reivindicación 9, caracterizado porque comprende además un promotor operativamente unido a la secuencia de ADN aislada y purificada.

11. Una célula huésped eucariota o procariota transfectada con el vector de expresión de las reivindicaciones 9 o 10.

12. Una composición farmacéutica caracterizada porque, comprende la proteína recombinante inhibidora de una calicreína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 como un agente activo, y opcionalmente en combinación con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.

13. Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 12, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno asociado a la proteolisis en un mamífero.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el trastorno es un trastorno en el que la actividad de la calicreína hK2 es perjudicial.

15. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 13 o 14, caracterizado porque el trastorno es un cáncer, un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio o un trastorno infeccioso.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque el cáncer es cáncer de próstata, cáncer de mama o un cáncer metastásico.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque el trastorno inflamatorio es hipertrofia prostática benigna.

18. Un método para producir la proteína inhibidor recombinante de una calicreína de la reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas de

a) seleccionar una secuencia polinucleotídica que codifica un sitio activo de sustrato específico para dicha calicreína, dicha secuencia consiste en una secuencia pentapéptido seleccionada entre SSRTE, KTRSN, ISPRS, GVFRS, GTVRS, ETKRS, LGRSL, RGRSE, RRSID, VLRSP, PFRSS, RSGSV, ARARS, SDRTA, KLRTT, RAAMM, TRAPM, DVRAA, PGRAP, VESRA, ARASE, TLQRV, RLERV, ERVSP, SSPRV, RVGPY, PSARM, RGRMA, TVRMP, LRMPT, HRMSS, RPQEL, VRPLE, SGRLA, GTLRF, QWRNS, RNDKL, MRNRA, TRDSR, TGSRD, IMSRQ, LTTSK, PFRKI específica para dicha calicreína, fragmentos biológicamente activos de estas, una quimera molecular de la misma, y/o una combinación de estos, b) introducir dicha secuencia pentapéptido en una secuencia que codifica una secuencia de serpina, para obtener una proteína recombinante inhibidora de dicha calicreína, c) permitir la expresión de dicha proteína recombinante inhibidora de dicha calicreína en un sistema de expresión celular bajo condiciones adecuadas, d) y recuperar la proteína recombinante inhibidora de dicha calicreína.

19. El método de la reivindicación 18, caracterizado porque las condiciones adecuadas consisten en cultivar el sistema de expresión celular a una temperatura entre 10-40°C durante 10-30 horas.

20. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque las condiciones adecuadas consisten en una temperatura de 16°C durante 16 horas.

21. El método de la reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque la etapa d) se alcanza por la separación después de la extracción de la proteína recombinante inhibidora de dicha calicreína a partir del sistema de expresión celular.

22. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque la separación de la proteína recombinante inhibidora de dicha calicreína se alcanza por cromatografía de afinidad.

23. El método de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizado porque la proteína recombinante inhibidora de dicha calicreína se ensaya adicionalmente para su capacidad para inhibir la actividad de dicha calicreína.

24. El método de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizado porque el sistema de expresión celular es una célula bacteriana.

25. Un kit diagnóstico para la detección de una calicreína en un espécimen caracterizado porque, comprende cualquier secuencia de ADN adecuada aislada y purificada, seleccionada del grupo de sec. con núm. de ident.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, y/o una secuencia complementaria de la misma.

26. Un kit diagnóstico para la detección de una calicreína en una muestra caracterizado porque, comprende la proteína recombinante inhibidora de una calicreína de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6.

Figura 10 B

Figura 11