Inactivación de patógenos con peróxido de hidrógeno para la producción de vacunas.

Un procedimiento para producir una composicion inmunogenica que comprende un patogeno viral inactivado,

comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto el pat6geno viral con una disolucion que comprende un agente oxidante en una cantidad ydurante un periodo de tiempo suficientes como para hacer al patogeno viral no infeccioso mientras que conserva lainmunogenicidad viral,

produciendo, de ese modo, una composicion de vacuna inmunogenica que comprende un pategeno viral inactivado.

Inactivación de patógenos con peróxido de hidrógeno para la producción de vacunas.

Campo La presente divulgación versa acerca del campo de las vacunas. Más específicamente, la divulgación versa acerca de procedimientos para preparar vacunas como se define en las reivindicaciones.

Antecedentes Los procedimientos actuales utilizados para inactivar patógenos vivos en la producción de vacunas implican el uso de agentes quimicos tales como formaldehido o betapropiolactona para modificar químicamente el material genético del patógeno. Sin embargo, existen pruebas sustanciales de que ambos agentes son carcinógenos humanos y animales. Por ejemplo, estudios en ratas expuestas a formaldehído mediante inhalación han mostrado que el formaldehldo induce carcinomas de células escamosas de la cavidad nasal. Además, se ha mostrado que el formaldehido es genotóxico in vitro e in vivo. Tanto la genotoxicidad y la citotoxicidad desempenan un papel importante en la carcinogenicidad del formaldehído.

Aunque la concentración de formaldehído en las vacunas es normalmente baja (inferior al 0, 02%) , esto representa hasta 50-100 microgramos de formaldehido por dosis inyectada en muchas vacunas (por ejemplo, la vacuna contra el ántrax producida por Bioport Corp. contiene 100 microgramos/ml de formaldehido como un conservante) y supone un riesgo potencial debido al número de vacunaciones que recibe una persona en el curso de su vida. Particularmente peligrosa es la cantidad de formaldehldo inyectada en bebés y en ninos pequenos en el curso de múltiples vacunaciones rutinarias de su ninez. Aunque la cantidad de formaldehido en cada dosis de vacuna es pequena, la cantidad combinada puede llegar a ser sustancial.

De forma similar, la betapropiolactona, que es utilizada en la inactivación del virus de la rabia, puede producir una reacción inmunitaria compleja cuando se combina con otros componentes de la vacuna de la rabia. Además, se ha mostrado que produce carcinomas, linfomas y hepatomas de células escamosas en ratones.

El documento GB933711 da a conocer un procedimiento para la producción de vacunas en el que se atenúa un endoparásito metazoario.

Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar una altemativa no tóxica de bajo coste al formaldehído y a la betapropiolactona para la inactivación de patógenos vivos, tales como virus. Los procedimientos dados a conocer en el presente documento abordan esta necesidad, y proporcionan beneficios sustanciales no descritos anteriormente en la técnica.

Resumen La presente divulgación proporciona procedimientos para producir una composición inmunogénica tal como una vacuna (por ejemplo, procedimientos para preparar un medicamento) que contiene un patógeno viral inactivado, tal como un patógeno viral completo inactivado, como se define en las reivindicaciones. Los procedimientos implican poner en contacto el patógeno viral con una disolución que incluye una cantidad eficaz de un agente oxidante, tal como peróxido de hidrógeno, durante un periodo suficiente como para volver al patógeno viral no infeccioso. Los procedimientos dados a conocer tienen como resultado una composición de vacuna libre de conservante que está sustancialmente libre de peróxido de hidrógeno, sin la necesidad de ninguna etapa intermedia de purificación.

Los procedimientos dados a conocer en el presente documento son adecuados para la preparación de composiciones inmunogénicas (por ejemplo, vacunas) para una amplia variedad de patógenos virales.

También se dan a conocer composiciones inmunogénicas, tales como vacunas que contienen un patógeno viral inactivado. Por ejemplo, la composición (o el medicamento) puede ser una composición inmunogénica liofilizada (por ejemplo, una preparación de vacuna) que contiene un patógeno que conserva uno o más epltopos antigénicos predominantes del patógeno viral biológicamente activo a partir del que fue preparada. La composición liofilizada está libre de conservantes y libre de cualquier agente de inactivación. La composición también puede ser un líquido preparado al reconstituir la composición liofilizada en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, la composición puede incluir un adyuvante adecuado que aumenta la eficacia antigénica del antígeno. También se describen procedimientos para suscitar una respuesta inmunitaria en un sujeto al administrar las composiciones que contienen un patógeno viral inactivado.

Lo anterior y otros objetos, características, y ventajas de la invención serán más evidentes tras el estudio de la siguiente descripción detallada y de las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos La FIG. 1 es un gráfico de barras que ilustra los resultados de un ELlSA que mide la antigenicidad de distintas preparaciones de antigeno del virus vaccinia (yV) en comparación con un virus vivo no tratado. En cada caso, se utilizaron cantidades idénticas de antígeno del virus para revestir la placa ELISA y se utilizó suero humano de un voluntario inmune al virus vaccinia (Dr y vax; vacuna viva contra la viruela) para determinar cuán bien podia ser reconocido el antígeno inactivado del virus por el suero inmune al W. Se muestran los resultados de distintos procedimientos de inactivación de izquierda a derecha: virus vaccinia vivo-sin tratamiento de inactivación; 100 oC durante 10 minutos; 56 oC durante 2 horas; 1% de formaldehído; luz UV-5 julios; luz UV-10 julios; 3% de H202. Se indica el valor de titulación en el eje Y.

La FIG. 2 es un gráfico de líneas que ilustra los resultados de un ELlSA que mide anticuerpos especificos contra el virus vaccinia después de la administración de vacunas contra el virus vaccinia preparadas utilizando distintos procedimientos de inactivación (. virus vaccinia (yV) vivo; O suero previo a la vacunación; • W inactivado con 1 Ilg

H202; O W inactivado con 0, 1 Ilg H202; Á W liofilizado inactivado con 1 Ilg H20 2; 11 W liofilizado inactivado con 0, 1 Ilg H202; • W dializado inactivado con 1 Ilg H2Ü2; O W dializado inactivado con 0, 1 Ilg H202) . Se muestra la puntuación ELlSA en el eje Y y los dias posteriores a la infección están indicados en el eje X.

La FIG. 3 es un gráfico de barras que ilustra la inactivación de un patógeno ejemplar en un amplio intervalo de concentraciones de H202. La titulación de virus vivo está indicada en el eje Y (ufp/ml) y el % de H202 está indicado en el eje X.

La FIG. 4A es una serie de gráficos de puntos que muestran un análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ específicos a antigenos después de la administración de vacunas contra el virus vaccinia preparadas con distintos procedimientos de inactivación (de izquierda a derecha: virus vivo; virus inactivado con H202; virus inactivado con formaldehído; virus inactivado con calor; y virus inactivado con luz UV) . La FIG. 48 es un gráfico de barras que ilustra la medición de titulaciones de anticuerpos neutralizantes especificos para el virus vaccinia (eje Y) después de la administración de vacunas preparadas mediante distintos procedimientos (de izquierda a derecha: inactivadas con H202; inactivadas con formaldehído; inactivadas con calor; inactivadas con luz UV y virus vivo) . La FIG. 4C es un gráfico de barras que ilustra los resultados de un ELlSA que detecta anticuerpos específicos contra el virus vaccinia (eje Y) después de la administración de vacunas contra el virus vaccinia preparadas mediante distintos procedimientos (de izquierda a derecha: inactivadas con H202; inactivadas con formaldehído; inactivadas con calor; inactivadas con luz UV y virus vivo) .

La FIG. 5A es un gráfico de barras que ilustra la titulación de virus (ufp/ml) de varios patógenos virales inactivados distintos (+) con un 3% de H2Ü2 o sin tratar {-l. De izquierda a derecha: virus de coriomeningitis linfocítico (LCMV) ; virus vaccinia (yV) ; virus de la viruela del simio (MPV) ; virus de la fiebre amarilla (YFV) ; y virus del Nilo occidental (WNV) . La FIG. 58 es un gráfico de barras que ilustra la inactivación del LCMV en un amplio intervalo de concentraciones de H202. La titulación de virus se indica en ufp/ml.

Descripción detallada Introducción La presente divulgación proporciona procedimientos para producir composiciones inmunogénicas, tales como vacunas, al exponer a los patógenos virales a un agente oxidante, tal como peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno posee una actividad antimicrobiana de amplio espectro, e inactiva de forma eficaz una amplia gama de patógenos, incluyendo los virus, las bacterias, y los parásitos. Normalmente, se han preparado vacunas no replicativas al tratar patógenos vivos con luz ultravioleta (inactivación con luz UV)... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una composición inmunogénica que comprende un patógeno viral inactivado, comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto el patógeno viral con una disolución que comprende un agente oxidante en una cantidad y durante un periodo de tiempo suficientes como para hacer al patógeno viral no infeccioso mientras que conserva la inmunogenicidad viral,

produciendo, de ese modo, una composición de vacuna inmunogénica que comprende un patógeno viral inactivado.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la composición de vacuna es, o fue, liofilizada subsiguientemente a la inactivación del patógeno viral.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el agente oxidante comprende peróxidO de hidrógeno.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende liofilizar la disolución para eliminar parte, la mayoria, o todo el agente oxidante.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición inmunogénica está libre de conservante.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se aisla o se purifica el patógeno viral antes de hacer contacto con el agente oxidante.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las etapas de poner en contacto el patógeno viral completo con el agente oxidante y de liofilizar la disolución son llevadas a cabo sin una etapa intermedia de purificación.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, siendo el virus un poxvirus, un flavivirus, un arenavirus, o un virus vaccinia.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en el que se escoge la disolución para que comprenda al menos un 0, 03%, o no más de un 30%, o un 3% de peróxido de hidrógeno (plvol) .

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que se pone en contacto el patógeno viral completo con la disolución que comprende el agente oxidante durante al menos cinco minutos, o durante al menos 30 minutos, o durante 2 horas.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que se pone en contacto el patógeno viral completo con la disolución que comprende el agente oxidante a una temperatura a O°C, o superior a la misma, o a una temperatura no superior a 42°C, o a una temperatura de 25°C, a temperatura ambiente, o a 4°C.

12. Una composición inmunogénica producida según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1

11.

13. Una composición de vacuna que comprende un patógeno viral inactivado oxidado, en la que la composición de vacuna está libre de conservantes y libre de cualquier agente de inactivación.

14. La composición de vacuna según la reivindicación 13, en la que el patógeno viral inactivado conserva uno o más epítopos antigénicos predominantes del patógeno viral biológicamente activo.

15. La composición de vacuna de la reivindicación 13, en la que la composición de vacuna está libre de formaldehido y de betapropiolactona.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o la composición de las reivindicaciones 12-14, siendo el virus un poxvirus, un flavivirus, un arenavirus, o un virus vaccinia.

17. Un procedimiento para preparar una composición inmunogénica adecuada para ser administrada para suscitar en un sujeto una respuesta inmunitaria contra un patógeno viral, comprendiendo el procedimiento preparar una composición inmunogénica de virus al poner en contacto un patógeno viral con una disolución que comprende un agente oxidante en una cantidad y durante un periodo de tiempo suficientes como para volver al patógeno viral no infeccioso.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el agente oxidante es peróxido de hidrógeno, y comprende, además, liofilizar la disolución que comprende peróxido de hidrógeno para prodUCir una composición liofilizada.

19. El procedimiento de la reivindicación 17 o 18, en el que la composición liofilizada tiene la forma de un polvo, un

microgránulo, o un liquido. 21

20. El procedimiento de la reivindicación 18, que comprende, además, reconstituir la composición liofilizada en un diluyente farmacéuticamente aceptable.

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