Identificación de oligonucleótidos para la captura, detección y cuantificación de ácidos nucleicos del virus de la hepatitis A.

Método de detección del virus de la hepatitis A (VHA) en una muestra biológica,

comprendiendo el método:

aislar los ácidos nucleicos de una muestra biológica de la que sospecha que contiene VHA, en la que los ácidos nucleicos se aíslan de la muestra biológica mediante un método que comprende:

i. poner en contacto un soporte sólido que comprende ácidos nucleicos de captura asociados con el mismo con una muestra biológica en condiciones de hibridación en las que las hebras del ácido nucleico diana hibridan con los ácidos nucleicos de captura; y

ii. separar el soporte sólido de la muestra,

y en el que los ácidos nucleicos de captura comprenden uno o más oligonucleótidos, en el que cada uno de los oligonucleótidos tiene una longitud no superior a aproximadamente 60 nucleótidos y comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:10, la SEQ ID NO:11, la SEQ ID NO:12, la SEQ ID NO:13 y la SEQ ID NO:14;

en el que el soporte sólido comprende perlas;

amplificar los ácidos nucleicos aislados utilizando al menos dos cebadores derivados de la 5' UTR del genoma de VHA,

en el que cada uno de los cebadores tienen una longitud de 10 a 60 nucleótidos y es suficientemente complementario a una porción de las hebras codificante y no codificante, respectivamente, del ácido nucleico aislado para hibridar con las mismas,

y en el que

(a) uno de los cebadores comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 y el otro cebador comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:2, o

(b) los cebadores tienen un 90% de identidad de secuencia con las secuencias de nucleótidos descritas en (a); y

detectar la presencia de los ácidos nucleicos amplificados como indicio de la presencia o ausencia de VHA en la muestra.

Identificación de oligonucleótidos para la captura, detección y cuantificación de ácidos nucleicos del virus de la hepatitis A.

Campo técnico La presente invención pertenece en general a los ensayos diagnósticos para virus. En concreto, la invención se refiere a ensayos basados en ácidos nucleicos para diagnosticar con precisión la infección por hepatitis A y detectar la hepatitis A en una muestra biológica.

Antecedentes de la invención La hepatitis A es una enfermedad de transmisión entérica que causa fiebre, malestar, anorexia, náuseas, molestia abdominal e ictericia El agente etiológico de la hepatitis A, el virus de la hepatitis A, es un pequeño virus esférico sin envoltura, clasificado en el género Hepatovirus de la familia Picornaviridae. El genoma de VHA consiste en una molécula de ARN lineal de una sola hebra, de 7, 5 kb, que codifica un precursor de poliproteínas que se procesa para producir las proteínas estructurales y las actividades enzimáticas necesarias para la replicación vírica (Najarian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82:2627-2632 (1985) ) . El VHA crece mal en cultivo celular, no es citopático, y produce bajos rendimientos de virus. Aunque el ARN de VHA extraído de viriones es infeccioso en cultivo celular (Locarnini et al., J. Virol. 37:216-225 (1981) y Siegl et al., J. Gen. Virol. 57:331-341 (1981) ) , la manipulación directa del genoma viral se vuelve difícil debido a su composición de ARN.

El VHA codifica cuatro proteínas de la cápside (A, B, C y D) que contienen los dominios antigénicos principales reconocidos por los anticuerpos de los individuos infectados. Además de las proteínas de la cápside, se han descrito dominios antigénicos en proteínas no estructurales tales como la 2A y la proteasa codificada vírica. Se ha descrito otro dominio antigénico de VHA importante en el punto de unión entre el precursor de la cápside P1 y 2A.

El VHA se adquiere normalmente por la vía fecal-oral, por contacto de persona a persona o por ingestión de agua o alimentos contaminados. Sin embargo, existe el potencial para la transmisión del VHA por productos de plasma combinado. La ausencia de una envoltura lipídica hace al VHA muy resistente a la inactivación fisicoquímica, y el virus puede soportar un tratamiento térmico convencional de los productos sanguíneos. Por lo tanto, el VHA, así como el parvovirus B19, se ha transmitido a través de la administración de derivados de plasma combinado. El desarrollo de ensayos de diagnóstico sensibles y específicos para identificar anticuerpos y/o antígenos de la hepatitis A en los individuos infectados, así como ensayos basados en ácidos nucleicos para detectar muestras virémicas para excluirlas de la transfusión representa un desafío importante para la salud pública.

La patente de EE.UU. Nº 5.290.677 de Robertson et al., describe la captura del virus VHA entero utilizando anticuerpos. Se aísla el ARN y se genera el ADNc. A continuación se amplifica el ADNc mediante PCR utilizando los cebadores de la región de la cápside VP1 y VP3 del genoma de VHA, y se detecta el producto amplificado utilizando sondas de la misma región del genoma. La selección de los cebadores y las sondas se basa en el genotipo del VHA a detectar.

Sigue existiendo la necesidad de desarrollar ensayos de diagnóstico fiables para detectar el virus de la hepatitis A en muestras virémicas, con el fin de evitar la transmisión del virus a través de derivados sanguíneos y del plasma o mediante el contacto personal estrecho.

Resumen de la invención La presente invención se basa en el desarrollo de un ensayo de diagnóstico basado en ácidos nucleicos, sensible y fiable, para la detección del VHA en muestras biológicas de individuos potencialmente infectados. Las técnicas descritas en el presente documento utilizan ácido nucleico extraído de la muestra como molde para la amplificación de regiones conservadas del genoma de la secuencia VHA utilizando PCR, amplificación mediada por transcripción (TMA) , así como en un ensayo de 5’-nucleasa, tal como la técnica TaqMan™. Los métodos permiten la detección del VHA en muestras virémicas. En determinadas formas de realización, la presente invención utiliza cebadores y sondas derivadas de la región 5’ UTR del genoma de VHA. Además, los métodos permiten un análisis en un único recipiente (“one-pot”) en el que los ácidos nucleicos de la muestra capturados pueden someterse a amplificación y detección en el mismo recipiente. Utilizando los métodos de la invención, las muestras infectadas pueden identificares y excluirse de la transfusión, así como de la preparación de derivados sanguíneos.

Por consiguiente, en una forma de realización, la presente invención se refiere a un método para detectar la infección por VHA en una muestra biológica. El método comprende:

aislar los ácidos nucleicos de una muestra biológica de la que se sospecha que contiene el VHA, en la que los ácidos nucleicos se aíslan de la muestra biológica mediante un método que comprende:

aislar ácidos nucleicos de una muestra biológica de la que sospecha que contiene el VHA, en la que los ácidos nucleicos se aíslan de la muestra biológica mediante un método que comprende:

i. poner en contacto un soporte sólido que comprende ácidos nucleicos de captura asociados con el mismo con una muestra biológica en condiciones de hibridación en las que las hebras de ácido nucleico diana hibridan con los ácidos nucleicos de captura; y

ii. separar el soporte sólido de la muestra, y en el que los ácidos nucleicos de captura comprenden uno o más oligonucleótidos, en el que cada uno de los oligonucleótidos tiene una longitud no superior a aproximadamente 60 nucleótidos y comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:10, la SEQ ID NO:11, la SEQ ID NO:12, la SEQ ID NO:13 y la SEQ ID NO:14; en el que el soporte sólido que comprende perlas;

amplificar los ácidos nucleicos aislados utilizando al menos dos cebadores derivados de la 5’ UTR del genoma de VHA, en el que cada uno de los cebadores tienen una longitud de 10 a 60 nucleótidos y es suficientemente complementario a una porción de las hebras codificante y no codificante, respectivamente, del ácido nucleico aislado para hibridar con las mismas, y en el que

(a) uno de los cebadores comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 y el otro cebador comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:2, o

(b) los cebadores tienen un 90% de identidad de secuencia con las secuencias de nucleótidos descritas en (a) ; y

detectar la presencia de los ácidos nucleicos amplificados como indicio de la presencia o ausencia de VHA en la muestra.

En determinadas formas de realización, las perlas son perlas magnéticas.

En determinadas formas de realización, el aislamiento, la amplificación y la detección se realizan en un único recipiente.

Preferentemente, los ácidos nucleicos de captura comprenden adicionalmente una cadena de homopolímero en el extremo 3’ o en el 5’ de aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud, en el que la cadena de homopolímero está seleccionada del grupo que consiste en poliA, poliT, poliG, poliC, y poliU.

Más preferentemente, la cadena de homopolímero es una cadena de poliA.

En determinadas formas de realización, la amplificación comprende PCR, amplificación mediada por transcripción (TMA) o Taq-Man.

Preferentemente la amplificación comprende TMA.

Preferentemente, dichos métodos de amplificación, comprenden adicionalmente el uso de un oligonucleótido sonda que comprende un marcador detectable para detectar la secuencia amplificada, en el que el oligonucleótido sonda tiene una longitud no superior a aproximadamente 60 nucleótidos y comprende al menos 10 nucleótidos contiguos que comprenden la SEQ ID NO:3.

Preferentemente, la sonda comprende marcadores detectables en el extremo 5’ y en el extremo 3'.

Preferentemente, el marcador detectable es un marcador fluorescente seleccionado del grupo que consiste en 6-carboxifluoresceína (6-FAM) , tetrametil rodamina (TAMRA) , y 2’, 4', 5’, 7', -tetracloro-4-7-diclorofluoresceína (TET) .

En una forma de realización adicional, la invención se refiere a un kit para detectar una infección por el virus de la hepatitis A (VHA) en una muestra biológica, comprendiendo el kit:

capturar los ácidos nucleicos que comprenden uno o más oligonucleótidos, en el que cada uno de los oligonucleótidos tiene una longitud... [Seguir leyendo]

1. Método de detección del virus de la hepatitis A (VHA) en una muestra biológica, comprendiendo el método:

aislar los ácidos nucleicos de una muestra biológica de la que sospecha que contiene VHA, en la que los ácidos nucleicos se aíslan de la muestra biológica mediante un método que comprende:

i. poner en contacto un soporte sólido que comprende ácidos nucleicos de captura asociados con el mismo con una muestra biológica en condiciones de hibridación en las que las hebras del ácido nucleico diana hibridan con los ácidos nucleicos de captura; y

ii. separar el soporte sólido de la muestra, y en el que los ácidos nucleicos de captura comprenden uno o más oligonucleótidos, en el que cada uno de los oligonucleótidos tiene una longitud no superior a aproximadamente 60 nucleótidos y comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:10, la SEQ ID NO:11, la SEQ ID NO:12, la SEQ ID NO:13 y la SEQ ID NO:14; en el que el soporte sólido comprende perlas;

amplificar los ácidos nucleicos aislados utilizando al menos dos cebadores derivados de la 5’ UTR del genoma de VHA, en el que cada uno de los cebadores tienen una longitud de 10 a 60 nucleótidos y es suficientemente complementario a una porción de las hebras codificante y no codificante, respectivamente, del ácido nucleico aislado para hibridar con las mismas, y en el que

(a) uno de los cebadores comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 y el otro cebador comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:2, o

(b) los cebadores tienen un 90% de identidad de secuencia con las secuencias de nucleótidos descritas en (a) ; y

detectar la presencia de los ácidos nucleicos amplificados como indicio de la presencia o ausencia de VHA en la muestra.

2. Método según la reivindicación 1, en el que las perlas son perlas magnéticas.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el aislamiento, la amplificación y la detección se realizan en un único recipiente.

4. Método según la reivindicación 3, en el que los ácidos nucleicos de captura comprenden adicionalmente una cadena de homopolímero en el extremo 3’ o en el 5’ de aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud, en el que la cadena de homopolímero está seleccionada del grupo que consiste en poliA, poliT, poliG, poliC, y poliU.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la cadena de homopolímero es una cadena poliA.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la amplificación comprende PCR, amplificación mediada por transcripción (TMA) o TaqMan.

7. Método según la reivindicación 6, en el que la amplificación comprende TMA.

8. Método según la reivindicación 6, que comprende adicionalmente el uso de una oligonucleótido sonda que comprende un marcador detectable para detectar la secuencia amplificada, en el que el oligonucleótido sonda tiene una longitud no superior a aproximadamente 60 nucleótidos y comprende al menos 10 nucleótidos contiguos que comprenden la SEQ ID NO:3.

9. Método según la reivindicación 8, en el que la sonda comprende marcadores detectables en el extremo 5’ y en el extremo 3'.

10. Método según la reivindicación 9, en el que el marcador detectable es un marcador fluorescente seleccionado del grupo que consiste en 6-carboxifluoresceína (6-FAM) , tetrametil rodamina (TAMRA) , y 2’, 4', 5’, 7', -tetracloro-4-7-diclorofluoresceína (TET) .

11. Kit para detectar una infección por virus de la hepatitis A (VHA) en una muestra biológica, comprendiendo el kit:

capturar los ácidos nucleicos que comprenden uno o más oligonucleótidos, en los que cada uno de los oligonucleótidos tiene una longitud no superior a aproximadamente 60 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:10, la SEQ ID NO:11, la SEQ ID NO:12, la SEQ ID NO:13 y la SEQ ID NO:14; al menos dos cebadores que los que (a) cada uno de los cebadores tiene una longitud no superior a aproximadamente 60 nucleótidos y un cebador comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10

nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 y el otro cebador comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:2; instrucciones escritas para identificar la infección por VHA; y un soporte sólido que comprende perlas.

12. Kit según la reivindicación 11, que comprende adicionalmente una polimerasa y tampones.

13. Kit según la reivindicación 11, que comprende adicionalmente un oligonucleótido sonda de no más de aproximadamente 60 nucleótidos de longitud y al menos 10 nucleótidos contiguos que comprenden la SEQ ID NO:3.

14. Kit según la reivindicación 13, en el que la sonda comprende adicionalmente marcadores detectables en el extremo 5’ y en el extremo 3'.

15. Kit según la reivindicación 14, en el que el marcador detectable es un marcador fluorescente seleccionado del

grupo que consiste en 6-carboxifluoresceína (6-FAM) , tetrametil rodamina (TAMRA) , y20 2’, 4', 5’, 7', -tetracloro-4-7-diclorofluoresceína (TET) .