Partículas similares a virus (VLPs) de Norovirus y Sapovirus.

Un método para producir partículas similares a virus (VLPs), el método comprende:

a) transformar una célula de levadura con un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante ligado operativamente a un promotor híbrido ADH2/GAPDH en donde el polinucleótido es seleccionado del grupo consistente de:

i) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1;

ii) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:2; y

iii) un polinucleótido que muestra al menos un 80-100% de identidad de secuencia con las secuencias de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2

b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones por las que las proteínas de la cápside se expresan y ensamblan en VLPs.

REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICIRUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos número de serie 60/739217, presentada el 22 de noviembre de 2005.

CAMPO TECNICO

La presente invención se refiere a un método para producir partículas similares a virus (VLPs) de Norovirus.

ANTECEDENTES

Los Norovirus (también conocidos como virus tipo Norwalk o virus de Norwalk) y los Sapovirus (también conocidos como virus tipo Sapporo) son agentes etiológicos de gastroenteritis aguda en adultos y niños (Green y otros, Infect. Dis. 181 (Suppl 2) :S322-330) . Los Norovirus y los Sapovirus son miembros de la familia Caliciviridae de virus sin envoltura, pequeños, de 27-35 nm de diámetro, que contienen una única cadena de ARN genómico de sentido positivo. Actualmente, los Norovirus y los Sapovirus son los únicos dos géneros de la familia Caliviridae que se conoce que causan enfermedad humana.

Los Norovirus causan más del 90% de los brotes de gastroenteritis no bacteriana y una estimación de 23 millones de casos de gastroenteritis en los Estados Unidos por año. (Fankhauser y otros (2002) J. Infect. Dis. 186:17; MMWR Morb. Mortal Weekly Rep. (2000) 49:207-211) . Aunque la cepa Norwalk de Norovirus fue la primera descubierta, ahora es evidente que el virus Norwalk causa menos del 10% de los casos de gastroenteritis, mientras que otros miembros de la familia de los Norovirus, como el virus Lordsdale, virus de Toronto, y virus de la Montaña Nevada, pueden causar el 90% de los casos (Fankhauser y otros (1998) J. Infect. Dis. 178:1571-1578; Nishida y otros (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69 (10) :5782-6) .

Los síntomas de la infección por Norovirus incluyen diarrea y vómitos simultáneos así como fiebre, dolores de cabeza, escalofríos y dolores de estomago. La causa de tales síntomas puede estar relacionada con el enlace de los Norovirus con los receptores de carbohidratos de las células epiteliales intestinales, lo que resulta en un desequilibrio en la transferencia de iones (Marionneau y otros (2002) Gastroenterology 122:1967-1977; Hutson y otros (2003) J. Virol. 77:405-415) . Extremadamente contagiosos, los Norovirus pueden causar infección con tan poco como 10 viriones. Aunque, personas por lo demás sanas infectadas con Norovirus puede recuperarse dentro de 2-4 días, aún pueden propagar el virus durante 2 semanas después del inicio de los síntomas; por lo tanto, los individuos infectados deberían ser puestos en cuarentena durante hasta dos semanas. Aproximadamente el 30-40% de las personas infectadas pueden permanecer libres de síntomas, aunque pueden propagar la infección diseminando virus a otros que pueden ser más susceptibles a la infección (Hutson y otros Trends Microbiol. 2004 Jun;12 (6) :279-287) .

Por el contrario, los Sapovirus son menos prevalentes en los brotes de gastroenteritis e infectan mayoritariamente a bebes y niños, aunque ocasionalmente a adultos (Zintz y otros (2005) Infect. Genet. Evol. 5:281290; Johansson y otros (2005) Scand. J. Infect. Dis. 37:200-204; Rockx y otros (2002) Clin. Infect. Dis. 35:246-253) . Los Sapovirus pueden también causar diarrea y vómitos y propagar la infección a través de diseminación viral, que puede durar hasta 2 semanas.

La US2003/129588 y Ball y otros ( (1996) Archives of Virology, vol 12 pp. 2430249) describen la expresión de las proteínas de la cápside del virus Norwalk en células de insecto. La WO05/032457 describe la expresión de las proteínas de la cápside del virus Norwalk en células de insecto. Boga y otros ( (1997) Journal of General Biology, Vol 78 (9) pp. 2315-2318) describen la expresión de la proteína de la cápside principal (VP60) del virus hemorrágico de conejo en células de insecto y levadura, e informa que la expresión de estas VLPs fue menor usando levadura que cuando se usaron células de insecto.

RESUMEN

La presente invención proporciona un método para producir VLPs. En particular, la invención proporciona un método para producir partículas similares a virus (VLPs) , el método comprendiendo:

a) transformar una célula de levadura con un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante ligado operativamente con un promotor híbrido ADH2/GAPDH en donde el polinucleótido es seleccionado del grupo consistente de:

(i) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1;

(ii) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2; y

(iii) un polinucleótido que muestra al menos un 80-100% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2;

b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones por las que las proteínas de la cápside se expresan y ensamblan en VLPs.

También se describen métodos para producir Norovirus y opcionalmente antígenos de fusión de múltiples epítopos derivados de Sapovirus o antígenos de fusión de poliproteínas. Las VLPS pueden ser también mezcladas o co-expresadas con adyuvantes (por ejemplo, mutantes desintoxicados de toxinas lábiles al calor (LT) de E.coli como LT-K63 o LT-R72) .

1. Un método para producir partículas similares a virus (VLPs) , el método comprendiendo:

a) transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante ligado operativamente con un promotor híbrido ADH2/GAPDH en donde el polinucleótido es seleccionado del grupo consistente de:

(i) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1;

(ii) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2; y

(iii) un polinucleótido que muestra al menos un 80-100% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2;

b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones por las que las proteínas de la cápside se expresan y ensamblan en VLPs.

2. El método de la realización 1, en donde uno o más de los vectores de expresión comprenden secuencias que codifican proteínas de la cápside de más de un aislado de Norovirus o Sapovirus.

3. El método de la realización 1 o la realización 2, comprendiendo además transformar las mencionadas células huésped con una o más secuencias que codifican una proteína estructura de un Norovirus o Sapovirus.

4. El método de cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en donde el mencionado vector de expresión comprende una o más secuencias codificantes de ORF1 y/o ORF3 de un Norovirus o Sapovirus.

5. El método de cualquiera de las realizaciones 1 a 4, comprendiendo además transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica un adyuvante.

6. El método de cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde la célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae.

7. El método de cualquiera de las realizaciones anteriores en donde el polinucleótido recombinante comprende además una secuencia que codifica un adyuvante.

8. El método de cualquiera de las realizaciones anteriores en donde el adyuvante es un mutante desintoxicado de una toxina lábil calor (LT) de E.coli seleccionada del grupo consistente de LT-K63 y LT-R72.

9. El método de la realización 8 en donde el polinucleótido recombinante es seleccionado del grupo consistente de:

a) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO:1; b) un polinucleótido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:1 que es capaz

de producir partículas similares a virus; c) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO;2; d) un polinucleótido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:2 que es capaz

de producir partículas similares a virus; e) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende al secuencia de la SEQ ID NO:3; f) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO:3 que es capaz de provocar una respuesta inmune contra la proteína de la cápside principal del virus Norwalk; g) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:4; h) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO:4 que es capaz de provocar una respuesta inmune contra la proteína de la cápside principal del virus Norwalk; i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOS: 3-4;

j) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NO:3-4 que es capaz de provocar... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir partículas similares a virus (VLPs) , el método comprende:

a) transformar una célula de levadura con un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante ligado operativamente a un promotor híbrido ADH2/GAPDH en donde el polinucleótido es seleccionado del grupo consistente de:

i) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1; ii) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:2; y iii) un polinucleótido que muestra al menos u.

8. 100% de identidad de secuencia con las secuencias de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2

b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones por las que las proteínas de la cápside se expresan y ensamblan en VLPs.

2. El método de la reivindicación 1, en donde uno o más de los vectores de expresión comprenden secuencias que codifican proteínas de la cápside de más de un aislado de Norovirus o Sapovirus.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además transformar la mencionada célula huésped con una o más secuencias que codifican una proteína estructural de un Norovirus o Sapovirus.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el mencionado vector de expresión comprende uno o más de las secuencias de codificación de ORF1-y/o ORF3-de un Norovirus o Sapovirus.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica un adyuvante.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el polinucleótido recombinante comprende además una secuencia que codifica un adyuvante.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el adyuvante es un mutante desintoxicado de una toxina lábil al calor (LT) de E. coli seleccionada del grupo consistente de LT-K63 y LT-R72.

9. El método de la reivindicación 8 en donde el polinucleótido recombinante es seleccionado del grupo consistente de:

a) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO:1; b) un polinucleótido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:1 que es capaz

de producir partículas similares a virus; c) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO:2; d) un polinucleótido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:2 que es capaz

de producir partículas similares a virus; e) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende al secuencia de la SEQ ID NO:3; f) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO:3 que es capaz de provocar una respuesta inmune contra la proteína de la cápside principal del virus Norwalk; g) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:4; h) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO:4 que es capaz de provocar una respuesta inmune contra la proteína de la cápside principal del virus Norwalk; i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOS: 3-4;

j) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NO:3-4 que es capaz de provocar una respuesta inmune contra un Norovirus o un Sapovirus; y

k) un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido de i) que es capaz de provocar una respuesta inmune contra un Norovirus o un Sapovirus.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se ensambla una VLP mosaico que comprende proteínas de la cápside de al menos dos cepas virales de Norovirus.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vector de expresión es un vector alfavirus.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el polinucleótido recombinante comprende además un terminador del factor alfa.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende un paso de purificar la VLP.