Constructos de encapsidación de replicones de alfavirus.

Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de amplificación 5' modificada con una longitud de entre 10 y 150 nucleótidos,

en donde la secuencia modificada proporciona un sitio de reconocimiento para la síntesis de ARN de alfavirus de cadena positiva pero no proporciona un sitio de reconocimiento para la encapsidación del ARN.

Constructos de encapsidación de replicones de alfavirus Descripción CAMPO TECNICO

La presente invención se refiere de forma general a composiciones farmacéuticas. En particular, la invención se refiere a secuencias de amplificación de funcionamiento, que actúan en cis que son deficientes como señales de encapsidación y a métodos de hacer y usar estas secuencias.

ANTECEDENTES

Los alfavirus comprenden un conjunto de virus trasmitidos por artrópodos genética, estructural y serológicamente relacionados de la familia Togaviridae. Se han clasificado veintiséis virus conocidos y subtipos de virus dentro del género alfavirus, incluyendo Virus Sindbis (SIN) , virus Semliki Forest (SFV) , virus del río Ross (RRV) , y virus de la encefalitis equina venezolana (EEV) .

Varios miembros del género alfavirus están siendo desarrollados como vectores de expresión de "replicones" para su uso como vacunas y terapéuticos. Los vectores de replicones pueden ser utilizados en varios formatos, incluyendo ADN, ARN y para hacer partículas similares a virus recombinantes que contienen los vectores de replicones (partículas de replicones) . Tales vectores de replicones se han derivado de alfavirus que incluyen, por ejemplo, SIN (Xiong et al. (1989) Science 243:1188-1191; Dubensky et al., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan et al. (1998) J. Virol. 72:950-958; Polo et al. (1999) PNAS 96:4598-4603) , Semliki Forest virus (Liljestrom (1991) Bio/Technology 9:1356-1361; Berglund et al. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565) , y VEE (Pushko et al. (1997) Virology 239:389-401) . Un amplio conjunto de la bibliografía ha demostrado ahora la eficacia de usar vectores de replicones de alfavirus para aplicaciones como vacunas (ver por ejemplo, Dubensky et al., ibid; Berglund et al., ibid; Hariharan et al., ibid, Pushko et al., ibid; Polo et al., ibid; Davis et al. (2000) J Virol. 74:371-378; Schlesinger & Dubensky (1999) Curr Opin. Biotechnol. 10:434-439; Berglund et al. (1999) Vaccine 17:497-507) .

El uso de de vectores de replicones de alfavirus como vacunas basadas en ácidos nucleicos puede proporcionar ciertas ventajas en comparación con otros vectores de expresión de ácidos nucleicos. A lo largo de los años, han emergido varios términos incluyendo vector de alfavirus, constructo de vector de alfavirus, replicón de alfavirus, replicón de ARN de alfavirus, Sistemas de Iniciación de Capas Vectoriales Eucariotas (ELVIS) , replicón de plásmido de alfavirus y similares para describir los vectores de replicones de alfavirus.

Además de su uso como vehículos de administración de genes, los vectores de replicones de alfavirus también han sido descritas para su uso para generar partículas virales o partículas similares a virus (partículas de replicones) , que son en sí mismas útiles en aplicaciones profilácticas y terapéuticas. Ver por ejemplo, Polo et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96 (8) :4598-4603. Las partículas de replicones de alfavirus se generan típicamente usando un sistema multi-componente que separa los varios elementos requeridos para la formación de partículas. Las separación de los varios elementos reduce el riesgo de generar virus competentes con la replicación no deseables. El sistema incluye típicamente: 1) un vector de replicón, que contiene elementos necesarios para su propia replicación intracelular (por ejemplo, secuencias de codificación de proteínas no estructurales) pero carece de uno o más elementos codificantes de proteínas estructurales necesarios para la producción de partículas de la progenie, y 2) uno o más constructos de casetes de expresión de proteínas estructurales (por ejemplo, auxiliares defectuosos) que codifican proteínas estructurales de alfavirus (por ejemplo, cápside, glicoproteínas) requeridas para la encapsidación. Los constructos de replicones y los constructos de auxiliares defectuosos pueden ser introducidos directamente en células como ARNs o lanzadas desde ADN en células transfectadas o transitoriamente o establemente (por ejemplo líneas celulares de encapsidación o PCL) . Ver por ejemplo, Polo et al. (1999) Proc. Natâ?l Acad. Sci USA 96:4598-4603; Patentes U.S. Nº 6, 465, 634; 6, 426, 196; 6, 376, 236; 6, 342, 372; 6, 015, 686 y 5, 843, 723. Dubensky, TW et al. (1996) J. Virology 70 (1) :508-519; Frolov et al. (1996) . Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (21) :1137111377) .

Idealmente, las poblaciones de partículas replicones de alfavirus usados en aplicaciones profilácticas o terapéuticas serán sustancialmente homogéneos y contendrán solamente el replicón de ADN. Sin embargo, incluso cuando los elementos de encapsidación están separados, pueden producirse partículas que contienen especies de ARN adicionales (por ejemplo ARN auxiliar defectuoso) . Esta encapsidación no deseable de especies de ARN no de replicones también es denominada "co-encapsidación". La US 2004/0235133 divulga métodos para la producción a gran escala de replicones de alfavirus. Frolova et al. (J. Virol 1997 71 (1) :248-58) investiga la presencia de singlas de encapsidación en el genoma del virus Sindbis.

Así, a pesar de los avances en la tecnología de vectores alfavirales, sigue habiendo una necesidad de composiciones farmacéuticas que comprenden y métodos para hacer y usar vectores alfavirales y partículas de replicones de alfavirus, por ejemplo para reducir la co-encapsidación.

RESUMEN

La presente invención incluye composiciones que comprenden secuencias de amplificación que están modificadas para ser defectuosas como señales de encapsidación y métodos para hacer y usar estas composiciones.

En un aspecto, la invención incluye un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de amplificación 5' modificada con una longitud de entre 10 y 150 nucleótidos, en donde la secuencia modificada proporciona un sitio de reconocimiento para la síntesis de ARN de alfavirus de cadena positiva (del intermediario de ARN de cadena negativa complementario) pero no proporciona un sitio de reconocimiento para la encapsidación de ARN. En ciertas realizaciones, la secuencia de amplificación 5' modificada comprende una secuencia que muestra homología reducida (identidad de secuencia) con las señales de encapsidación a nivel de secuencia primario, mientras que la estructura secundaria sigue siendo la de la secuencia de amplificación original. En ciertas realizaciones, la secuencia de amplificación 5' modificada es ARN. Además, en ciertas realizaciones, la secuencia de amplificación 5' modificada comprende cualquiera de las SEQ ID NOs:4-16 o una secuencia que muestra al menos de alrededor del 50% a alrededor del 60% (o cualquier valor entre ellos, por ejemplo 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%) de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs:4 a 16, una secuencia que muestra al menos de alrededor del 60% a alrededor del 70% (o cualquier valor entre ellos, por ejemplo 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%) de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs:4 a 16, una secuencia que muestra al menos de alrededor del 70% a alrededor del 80% (o cualquier valor entre ellos, por ejemplo 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%) de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ IOD NOs:4 a 16, una secuencia que muestra al menos de alrededor del 80% a alrededor del 90% (o cualquier valor entre ellos, por ejemplo 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%) de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs:4 a 16, o una secuencia que muestra al menos de alrededor del 90% al 99% (o cualquier valor entre ellos, por ejemplo 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs:4 a 16.

En cualquiera de las secuencias de amplificación 5' modificadas descritas en la presente, la secuencia puede ser sintética y/o puede estar derivada de una secuencia seleccionada del grupo consistente de una secuencia 5' de alfavirus nativa, una secuencia 5' de alfavirus DI no nativa, una secuencia viral derivada no de alfavirus y una secuencia derivada de ARN celular, siempre que la secuencia modificada proporcione un sitio de reconocimiento para la síntesis del ARN de alfavirus de cadena positiva pero no proporcione un sitio de reconocimiento para la encapsidación del ARN. En ciertas realizaciones, la secuencia de amplificación 5' modificada comprende una secuencia que muestra menos de un 90% de identidad con una secuencia 5' de alfavirus nativa, una secuencia 5' de alfavirus DI no nativa, una secuencia viral derivada no de alfavirus o una secuencia derivada de ARN celular. En otras realizaciones, la secuencia de amplificación 5' modificada comprende una secuencia que muestra menos de un 70% de identidad de secuencia con una secuencia 5'... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de amplificación 5' modificada con una longitud de entre 10 y 150 nucleótidos, en donde la secuencia modificada proporciona un sitio de reconocimiento para la síntesis de ARN de alfavirus de cadena positiva pero no proporciona un sitio de reconocimiento para la encapsidación del ARN.

2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde el polinucleótido es ARN.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde la secuencia de amplificación 5' modificada comprende una secuencia que muestra al menos alrededor del 80% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs: 4-16.

4. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en donde la secuencia de amplificación 5' modificada está derivada de una secuencia seleccionada del grupo consistente de una secuencia 5' de alfavirus nativa, una secuencia 5' de alfavirus DI no nativa, una secuencia viral no de alfavirus y una secuencia de ARN celular.

5. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en donde la secuencia de amplificación modificada es sintética.

6. Un constructo de vector de ARN que comprende la secuencia de amplificación 5' de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. El constructo de vector de la reivindicación 5, que comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un promotor de la región de unión de alfavirus, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una o más proteínas estructurales de alfavirus; y una secuencia de reconocimiento de polimerasa de ARN.

8. El constructo de vector de la reivindicación 7, que comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un marcador seleccionable.

9. El constructo de vector de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde el vector no codifica todas las proteínas no estructurales de alfavirus biológicamente activas.

10. El constructo de vector de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, donde las proteínas estructurales de alfavirus son las glicoproteínas E2 y E1.

11. El constructo de vector de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde la proteína estructural de alfavirus es una proteína de la cápside.

12. El constructo de vector de cualquiera de las reivindicaciones 6-11, en donde las secuencias están derivadas de más de un alfavirus.

13. Un constructo de vector de alfavirus, que comprende un promotor 5' ligado operativamente a una molécula de ácido nucleico, en donde dicha molécula de ácido nucleico es ADN complementario al vector de ARN de acuerdo con las reivindicaciones 6-12.

14. El constructo de vector de alfavirus de la reivindicación 13, que comprende además una secuencia 3' que controla la terminación de la transcripción.

15. El constructo de vector de alfavirus de la reivindicación 14, en donde el promotor 5' es un promotor eucariota.

16. El constructo de vector de alfavirus de la reivindicación 14, en donde el promotor 5' es un promotor procariota.

17. Una célula que comprende un constructo de vector de alfavirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-16.

18. Una línea celular de encapsidación de alfavirus, que comprende una célula huésped y uno o más vectores de alfavirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-13.

19. Una célula auxiliar para producir una partícula de alfavirus defectuosa, infecciosa, que comprende en una célula permisiva de alfavirus:

un vector de replicón de alfavirus; y uno o más constructos auxiliares separados que codifican la proteínas estructurales de alfavirus ausentes del vector de replicón, en donde al menos uno de los mencionados constructos auxiliares separados comprende una secuencia de amplificación 5' modificada de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 y en donde 28

adicionalmente la expresión combinada del vector de replicón y los vectores auxiliares separados produce una partícula de alfavirus ensamblada que comprende una o más secuencias heterólogas, es capaz de infectar una célula, y es incapaz de completar la replicación viral.

20. La célula auxiliar de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende dos constructos auxiliares separados, en donde el primer constructo auxiliar codifica una proteína de la cápside de alfavirus y un segundo constructo codifica glicoproteínas de alfavirus.

21. La célula auxiliar de acuerdo con la reivindicación 19 o la reivindicación 20, en donde todos de los uno o más constructos auxiliares separados comprende una secuencia de amplificación 5' modificada.

22. La célula auxiliar de acuerdo con las reivindicaciones 19 a 21, en donde la mencionada célula auxiliar es transfectada con los vectores de replicones de alfavirus y el uno o más constructos auxiliares separados.

23. Un método para hacer partículas de alfavirus, defectuosas en replicación, infecciosas, que comprende:

a. proporcionar una célula auxiliar de acuerdo con las reivindicaciones 19 a 22;

b. producir las partículas de alfavirus en la célula auxiliar; y

c. recolectar las partículas de alfavirus producidas de la célula auxiliar.

24. Una composición que comprende partículas de alfavirus, defectuosas en replicación, infecciosas producidas de acuerdo con el método de la reivindicación 23, en donde la composición está libre de partículas de alfavirus competentes en replicación detectables.

25. Una formulación farmacéutica que comprende partículas de alfavirus, defectuosas en replicación, infecciosas producidas por el método de la reivindicación 23 en un portador farmacéuticamente aceptable.

26. Un método para hacer una secuencia de amplificación 5' modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende los pasos de

a. determinar regiones de homología de secuencia entre una secuencia de amplificación 5' conocida y una secuencia que contiene una señal de encapsidación viral; y

b. alterar la secuencia primaria de la secuencia de amplificación 5' conocida de tal forma que la homología con la secuencia que contiene la señal de encapsidación viral se reduce pero la función de amplificación se mantiene, haciendo de este modo una secuencia de amplificación 5' modificada.

27. El método de la reivindicación 26, en donde la secuencia de amplificación 5' modificada es seleccionada del grupo consistente de una secuencia 5' de alfavirus nativa, un extremo 5' de alfavirus DI no nativo, una secuencia viral no de alfavirus y una secuencia de ARN celular.