Glicoproteína hialuronidasa soluble (shasegp), proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden.

Una glicoproteína sustancialmente purificada que comprende un polipéptido hialuronidasa soluble activo a pH neutro que contiene al menos un resto azúcar ligado a N,

en el que:

el resto azúcar ligado a N está unido covalentemente a un resto asparagina del polipéptido;

la glicoproteína sustancialmente purificada comprende una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1 o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 91% con una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1; y

la glicoproteína sustancialmente purificada es soluble.

Glicoproteína hialuronidasa soluble (sHASEGP) , proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden.

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica prioridad de acuerdo con 35 U.S.C. § 119 (e) respecto al documento U.S. de Número de Serie 60/452.360, presentado el 5 de marzo de 2003.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención La presente invención se refiere en general a glicoproteínas hialuronidasa solubles activas a pH neutro (sHASEGP) , porciones de las mismas, particularmente dominios hialuronidasa. Más específicamente, la invención se refiere a modificaciones químicas, composiciones farmacéuticas, plásmidos de expresión, métodos para la fabricación y métodos terapéuticos que usan las glicoproteínas hialuronidasas y dominios de las mismas y las moléculas de ácido nucleico codificantes para la modificación terapéutica de glicosaminoglicanos en el tratamiento de una enfermedad y para el uso para aumentar la difusión de otras moléculas inyectadas de menos de 200 nanómetros de diámetro en un animal.

Información anterior

Los glicosaminoglicanos (GAG) son polisacáridos lineales complejos de la matriz extracelular (ECM) . Los GAG se caracterizan por estructuras disacáridas repetidas de una hexosamina N-sustituida y un ácido urónico, [hialuronano (HA) , sulfato de condroitina (CS) , condroitina (C) , sulfato de dermatán (DS) , sulfato de heparán (HS) , heparina (H) ],

o una galactosa, [sulfato de queratán (KS) ]. Excepto por el HA, todos se presentan unidos covalentemente a proteínas de núcleo. Los GAG con sus proteínas de núcleo se denominan estructuralmente proteoglicanos (PG) .

El hialuronano (HA) se encuentra en mamíferos predominantemente en tejidos conjuntivos, piel, cartílago y en líquido sinovial. El hialuronano también es el constituyente principal del humor vítreo del ojo. En el tejido conjuntivo, el agua de hidratación asociada con el hialuronano genera espacios entre tejidos, generando de este modo un entorno que conduce a movimiento y proliferación celular. El hialuronano desempeña un papel clave en fenómenos biológicos asociados con la motilidad celular incluyendo el desarrollo rápido, regeneración, reparación, embriogénesis, desarrollo embrionario, cicatrización de heridas, angiogénesis y oncogénesis (Toole 1991 Cell Bioll Extracell. Matrix, Hay (ed.) , Plenum Press, Nueva York, 1384-1386; Bertrand et al. 1992 Int. J. Cancer 52: 1-6; Knudson et al, 1993 FASEB J. 7: 1233-1241) . Además, los niveles de hialuronano se correlacionan con la agresividad tumoral (Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20: 600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36: 2133-2139; Kimata et al. 1983 Cáncer Res.43: 1347-1354) .

El HA se encuentra en la matriz extracelular de muchas células, especialmente en tejidos conjuntivos blandos. Al HA se le han asignado diversas funciones fisiológicas, tales como en la homeostasis del agua y de proteínas plasmáticas (Laurent TC et al (1992) FASEB J 6: 2397-2404) . La producción de HA aumenta en células en proliferación y puede desempeñar un papel en la mitosis. También se ha implicado en la locomoción y en la migración celular. El HA parece desempeñar papeles importantes en la regulación, desarrollo y diferenciación celular (Laurent et al, anteriormente) .

El HA se ha usado en la medicina clínica. Su propiedades reológicas y protectoras de tejidos han demostrado utilidad en la cirugía oftálmica para proteger el endotelio corneal durante la cirugía de cataratas. El HA sérico es diagnóstico de enfermedad hepática y diversas afecciones inflamatorias, tales como artritis re6umatoide. El edema intersticial causado por acumulación de HA puede causar disfunción en diversos órganos (Laurent et al, anteriormente) .

Las interacciones proteicas del hialuronano también están implicadas en la estructura de la matriz extracelular o “sustancia fundamental”.

Las hialuronidasas son un grupo de enzimas activas a pH neutro y a pH ácido que se encuentran por todo el reino animal. Las hialuronidasas varían con respecto a la especificidad de sustrato y mecanismo de acción.

Existen tres clases generales de hialuronidasas:

1. Hialuronidasas de tipo mamífero, (EC 3.2.1.35) que son endo-beta-N-acetilhexosaminidasas con tetrasacáridos y hexasacáridos como los productos finales principales. Tienen actividades tanto hidrolítica como transglicosidasa y pueden degradar el hialuronano y los sulfatos de condroitina (CS) , en concreto C4-S y C6 -S.

2. Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.99.1) , degradan el hialuronano y en diversos grados CS y DS. Son endobeta-N-acetilhexosaminidasas que funcionan mediante una reacción de beta-eliminación que produce principalmente productos finales disacáridos.

3. Las hialuronidasas (EC 3.2.1.36) de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos son endo-beta-glucuronidasas que generan productos finales tetrasacáridos y hexasacáridos a través de la hidrólisis del enlace beta 1-3.

Las hialuronidasas de mamífero pueden dividirse adicionalmente en dos grupos: enzimas activas a pH neutro y activas a pH ácido. Existen seis genes de tipo hialuronidasa en el genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3 HYAL4 HYALP1 y PH20/SPAM1. HYALP1 es un pseudogén y no se ha demostrado que HYAL3 posea actividad enzimática hacia ningún sustrato conocido. HYAL4 es una condroitinasa y carece de actividad hacia hialuronano. HYAL1 es la enzima activa a pH ácido prototípica y PH20 es la enzima activa a pH neutro prototípica. Las hialuronidasas activas a pH ácido, tales como HYAL1 y HYAL2, carecen de actividad catalítica a pH neutro. Por ejemplo, la HYAL1 no tiene actividad catalítica in vitro sobre pH 4, 5 (Frost et al Anal Biochemistr y , 1997) . HYAL2 es una enzima activa a pH ácido con una actividad específica muy baja in vitro.

Las enzimas de tipo hialuronidasa también pueden estar caracterizadas por las que están inmovilizadas en la membrana plasmática a través de un anclaje glicosilfosfatidilinositol tal como HYAL2 humana y PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 15 de abril de 2003; 100 (8) : 4580-5, Phelps et al., Science 1988) y las que son solubles, tales como HYAL1 humana (Frost et al, Biochem Biophys Res Commun. 9 de julio de 1997; 236 (1) : 10-5) . Sin embargo, existen variaciones entre especies: por ejemplo, la PH20 bovina se unen muy débilmente a la membrana plasmática y no se ancla mediante un anclaje sensible a fosfolipasa (Lalancette et al, Biol Reprod., agosto 2001; 65 (2) : 628-36.) . Esta característica única de la hialuronidasa bovina ha permitido el uso de la enzima hialuronidasa de testículos bovinos soluble como un extracto para uso clínico (Wydase , Hyalase ) . Otras especies de PH20 son enzimas ancladas a lípidos que no son insolubles sin el uso de detergentes o lipasas. Por ejemplo, la PH20 humana se ancla a la membrana plasmática a través de un anclaje GPI. Los intentos para preparar construcciones de ADN de PH20 humana que no introducirían un anclaje lipídico en el polipéptido dieron como resultado una enzima catalíticamente inactiva o una enzima insoluble (Arming et al Eur J Biochem. 1 de Agosto de 1997;247 (3) : 810-4) . La hialuronidasa de esperma de macaco de origen natural se encuentra en forma tanto soluble como unida a membrana. Mientras que la forma unida a membrana de 64 kDa posee actividad enzimática a pH 7, 0, la forma de 54 kDa sólo es activa a pH 4, 0 (Cherr et al, Dev Biol. 10 de abril de 1996; 175 (1) : 142-53) . Por lo tanto, las formas solubles de PH20 carecen con frecuencia de actividad enzimática en condiciones neutras.

Las condroitinasas son enzimas que se encuentran por todo el reino animal. Estas enzimas degradan los glicosaminoglicanos a través de una reacción endoglicosidasa. Los ejemplos específicos de condroitinasas conocidas incluyen condroitinasa ABC (obtenida de Proteus vulgaris; Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 6-153947, T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi y S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968) , S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, y T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543 (1968) ) , condroitinasa AC (obtenida de Flavobacterium heparinum; T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi y S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968) ) , condroitinasa AC II (obtenida de Arthrobacter aurescens; K. Hiyama y S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824 (1975) , K. Hiyama y S. Okada, J. Biochem. (Tokyo) , 80, 1201 (1976) ) , hialuronidasa ACIII (obtenida de Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa y Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989) ) , condroitinasa B (obtenida de Flavobacterium eparinum;... [Seguir leyendo]

1.Una glicoproteína sustancialmente purificada para el uso en una composición farmacéutica, donde dicha glicoproteína sustancialmente purificada comprende un polipéptido hialuronidasa soluble activo a pH neutro que contiene al menos un resto azúcar ligado a N, y es obtenible mediante expresión recombinante como una proteína secretada, donde: el resto azúcar ligado a N esta unido covalentemente a un resto asparagina del polipéptido; la glicoproteína sustancialmente purificada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 95 % con una secuencia de aminoácidos expuesta en los amino ácidos 1448 de SEC ID NO: 4; y la glicoproteína sustancialmente purificada es soluble.

2.La glicoproteína sustancialmente purificada para el uso en una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1-448 de la SEC ID NO: 4 o los aminoácidos 1-482 de la SEC ID Nº: 1.

3.La glicoproteína sustancialmente purificada para el uso en una composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 48.

4.La glicoproteína sustancialmente purificada para el uso en una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el polipéptido esta codificado por una molecula de acido nucleico que lo codifica los amino acidos 1-477, 1-478, 1-479, 1-480, 1-481, 1-482, o 1-483 de SEC ID NO: 1.

5.La glicoproteína sustancialmente purificada para el uso en una composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el polipéptido se secreta en células CHO.

6.Una glicoproteína sustancialmente purificada para el uso en una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el polipéptido está modificado con un polímero.

7.Una glicoproteína sustancialmente purificada para el uso en una composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que el polímero es PEG o dextrano.

8.La glicoproteína sustancialmente purificada para el uso en una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la que el polipéptido se produce por expresión en células de mamífero de una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1-482 de la SEC ID Nº: 1 o una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1-448 de la SEC ID Nº: 1.

9.La glicoproteína sustancialmente purificada para el uso en una composición farmacéutica según la reivindicación 8, en la que la célula de mamífero es una célula CHO.

10. La glicoproteína sustancialmente purificada para el uso en una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la composición farmacéutica comprende además un agente farmacéuticamente activo.

11. La glicoproteína sustancialmente purificada para el uso en una composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la que el agente farmacéuticamente activo se selecciona de entre un agente quimioterápico, un agente analgésico, un agente antiinflamatorio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonicida, un agente antiparkinsoniano, un gente antimalárico, un agente anticonvulsivante, un agente antidepresor, un agente antiartrítico, un agente antifúngico, un agente antihipertensor, un agente antipirético, un agente antiparasitario, un agente antihistamínico, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente alfa-bloqueante, un agente anestésico, un agente broncodilatador, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueante beta-adrenérgico, un agente bloqueante de canales de calcio, un agente farmacológico cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente descongestivante, un agente diurético, un agente depresor, un agente de diagnóstico, un agente electrolítico, un agente hipnótico, un agente hormonal, un agente hiperglucemiante, un agente relajante muscular, un agente de contracción muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpaticomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un agente simpaticomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente vitamínico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, una molécula orgánica o un inductor del sueño.

12.Un método para producir una glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 1, que comprende: introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la reivindicación 1 unido operativamente a un promotor adecuado en una célula capaz de incorporar restos de azúcares ligados a N en el polipéptido; cultivar la célula en condiciones por las que se exprese el polipéptido codificado por la célula y secretada; y recuperar el polipéptido expresado.

13.El método de la reivindicación 12, en el que la célula es una célula CHO.