Genoma del Bifidobacterium CNCM I-2618.

Bifidobacterium longum cepa CNCM I-2618.

Genoma del Bifidobacterium CNCM I-2618

La presente invención se refiere a un nuevo microorganismo del género Bifidobacterium longum, en concreto a su secuencia genómica. Se da a conocer un soporte de datos que comprende las secuencias de nucleótidos de NCC2705. Además, la presente invención se refiere a la cepa de Bifidobacterium longum NCC2705 y también a composiciones alimentarias y farmacéuticas que contienen dicho Bifidobacterium para la prevención y/o tratamiento de la diarrea provocada por rotavirus y bacterias patógenas.

Desde hace décadas se conocen los organismos que producen ácido láctico como componente metabólico principal. Estas bacterias se hallan normalmente en la leche o en fábricas procesadoras de leche, respectivamente, en plantas vivas o en estado de descomposición y también en el intestino del hombre y de los animales. Estos microorganismos agrupados bajo el término “bacterias lácticas”, representan un grupo bastante poco homogéneo y comprenden los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediocaccus etc.

El hombre ha utilizado las bacterias lácticas como agentes fermentadores para la conservación de alimentos aprovechando su pH bajo y la acción de productos generados durante la actividad fermentadora de las mismas para inhibir el crecimiento de bacterias contaminantes. Además, las bacterias lácticas también se han utilizado para la preparación de una serie de alimentos diferentes tales como quesos, yogures y otros productos lácteos fermentados a partir de la leche.

De forma bastante reciente, las bacterias lácticas han generado mucho interés al observarse que algunas cepas muestran propiedades valiosas para el hombre y los animales tras su ingestión. En concreto, se ha observado que cepas específicas de los géneros Lactobacillus o Bifidobacterium pasan a lo largo del tracto gastro-intestinal en forma viva y viable sin ser destruidas en la parte superior del mismo, especialmente por el impacto del pH bajo que predomina en el estómago, siendo capaces de colonizar la mucosa intestinal, suponiéndose que su permanencia temporal o mantenida en el intestino genera numerosos efectos positivos sobre la salud de los seres vivos. Estas cepas se denominan de forma genérica probióticos.

La patente EP 0 768 375 da a conocer una cepa específica del género Bifidobacterium, que es capaz de implantarse en la flora intestinal y que puede adherirse a las células intestinales. Se ha notificado que este Bifidobacterium colabora en la modulación de la inmunidad, siendo capaz de excluir de forma competitiva la adhesión a las células intestinales de bacterias patógenas, contribuyendo de este modo al mantenimiento de la salud del individuo.

A la vista de las valiosas propiedades que pueden producir cepas concretas de bacterias lácticas, existe en la técnica el interés por cepas adicionales de bacterias lácticas que sean beneficiosas para el bienestar del hombre y/o los animales. Además, interesa poseer información más detallada en relación a la biología de estas cepas, en concreto en lo que se refiere a la interacción con los huéspedes, los fenómenos del paso a través de diferentes condiciones ambientales en el intestino, así como a la capacidad de adherirse a la mucosa intestinal y eventualmente a su papel en el incremento del sistema inmunitario y de defensa contra patógenos, permitiendo dicha información una mejor comprensión de estos mecanismos.

Por consiguiente, un problema que aborda la presente invención es dar a conocer datos substanciales sobre cepas 45 bacterianas que muestran propiedades beneficiosas para el hombre y/o los animales.

A la vista de dicho problema, un tema de la presente invención versa sobre la secuencia de nucleótidos mostrada en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO 02/074798 de la bacteria láctica Bifidobacterium longum NCC2705. Sin embargo, la invención no queda limitada a la secuencia mostrada en el identificador de secuencia nº1

de la patente WO 02/074798, si no que engloba genomas y nucleótidos que codifican polipéptidos de variantes de la cepa, polimorfismos, variantes alélicas y mutantes de la misma.

En las figuras,

La figura 1 muestra un gráfico que indica la capacidad de Bifidobacterium longum NCC2705 de adherirse a las células intestinales humanas en cultivo; como comparación se utilizó la cepa Bifidobacterium BL28 Cal;

La figura 2 muestra la sensibilidad patogénica de bacterias patógenas frente a Bifidobacterium longum NCC2705;

La figura 3 muestra la actividad de las líneas celulares NCC2705 y BI 28 contra la infección de células Caco-2 por

S. typhimurium SL1344;

La figura 4 muestra la tasa de supervivencia de ratones infectados con Salmonella typhimurium SL 1344 y tratados con Bifidobacterium NCC2705; 65

La figura 5 muestra un esquema que ilustra el cribado de cultivos celulares para evaluar las propiedades protectoras frente a rotavirus de la cepa bacteriana NCC 2705.

La presente invención se basa en la secuenciación de genoma completo del genoma de Bifidobacterium longum 5 cepa NCC2705, depositado en el Instituto Pasteur, según el Tratado de Budapest de 29 de Enero de 2001, recibiendo el nºde depósito CNCM I- I-2618.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo formado por (a) la secuencia de nucleótidos mostrada en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO 02/074798, y

una secuencia de nucleótidos que muestra una identidad de al menos el 90% con la secuencia mostrada en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO 02/074798.

Los términos genoma o secuencia genómica deben entenderse que significan la secuencia del cromosoma de Bifidobacterium longum. El término plásmido debe entenderse que denomina cualquier trozo de ADN 15 extracromosómico contenido en el Bifidobacterium de la presente invención. Secuencia de nucleótido, polinucleotido o ácido nucleico deben entenderse que denominan el ADN de doble cadena, ADN de cadena única o los productos de la transcripción de dichos ADNs de diversas longitudes, incluyendo oligonucleótidos de aproximadamente entre 10 y 100 nucleótidos de longitud.

Una secuencia de nucleótidos homóloga según la presente invención se entiende que significa una secuencia de nucleótidos que posee un porcentaje de identidad con las bases de la secuencia de nucleótidos del identificador de secuencia nº1 o nº2 de al menos el 90%, más preferentemente del 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Dichos homólogos pueden comprender, por ejemplo, las secuencias correspondientes a la secuencia genómica o a las secuencias de los fragmentos representativos de una bacteria perteneciente a la especie Bifidobacterium, preferentemente la especie Bifidobacterium longum, así como las secuencias correspondientes a la secuencia genómica o a las secuencias de los fragmentos representativos de una bacteria perteneciente a las variantes de la especie Bifidobacterium. En la presente invención, los términos especie y género son mutuamente intercambiables.

Estas secuencias homólogas pueden, por lo tanto, corresponder a variaciones asociadas a mutaciones dentro de la misma especie o entre especies y pueden corresponder, en concreto, a truncamientos, substituciones, deleciones y/o adiciones de al menos un nucleótido. Dichas secuencias homólogas también pueden corresponder a variaciones asociadas a la degeneración del código genético o a sesgos en el código genético específicos de la familia, de la especie o de la variante y que es posible que estén presentes en Bifidobacterium.

Las homologías entre secuencias de proteínas y/o ácidos nucleicos pueden evaluarse utilizando cualquiera de los diferentes programas y algoritmos de comparación conocidos en la técnica. Dichos programas y algoritmos incluyen, pero sin carácter limitativo en modo alguno, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, y CLUSTALW (ver, por ejemplo, Pearson y Lipman, 1988 Proc. Natl Acad. Sci. USA 85 (8) : 2444-2448; Altschul y otros, 1990, J. Mol. Biol. 215 (3) : 403-410; Thompson y otros, 1994, Nucleic Acids Res. 22 (2) : 4673-4680; Higgins y otros, 1996, Methods Enzymol.

266: 383-402; Altschul y otros, 1990, J. Mol. Biol 215 (3) :403-410; Altschul y otros, 1993, Nature Genetics 3: 266272) .

Las homologías entre secuencias de proteínas y ácidos nucleicos se evalúan utilizando la herramienta “Basic Local Aligment Search Tool” (Herramienta básica de búsqueda de alineamientos locales) (“BLAST”) bien conocida en la 45 técnica (ver más arriba) . En concreto, se han utilizado cuatro programas BLAST específicos para realizar las siguientes... [Seguir leyendo]

1. Bifidobacterium longum cepa CNCM I-2618.

2. Polinucleótido que posee la secuencia de nucleótidos identificada por a) La secuencia de nucleótidos de Bifidobacterium longum cepa CNCM I-2618, tal como se da a conocer en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO02/074798; b) Una secuencia de nucleótidos que muestra una identidad de al menos el 90% con la de Bifidobacterium longum cepa CNCM I-2618, tal como se da a conocer en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO02/074798.

3. Utilización de un polinucleótido, según la reivindicación 2, para elucidar las interacciones entre huésped y bacteria en una muestra.

4. Utilización, según la reivindicación 3, en la que la interacción se basa en las propiedades anti-patógenas y/o anti15 virales de las cepas bacterianas.

5. Kit que comprende un polinucleótido, según la reivindicación 2.

6. Medio informático legible que tiene registrada la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 2. 20

7. Medió informático legible, según la reivindicación 6, en el que dicho medio se selecciona del grupo formado por: a) Un disquete; b) Un disco duro; c) Una memoria de acceso aleatorio (RAM)

d) Una memoria de sólo lectura (ROM) ; y e) Un CD-ROM

8. Sistema informático para identificar fragmentos del genoma de Bifidobacterium longum que comprende los elementos siguientes:

a) Un medio de almacenamiento de datos que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 2; b) Medios de búsqueda para comparar una secuencia diana con la secuencia de nucleótidos del medio de almacenamiento de datos de la etapa (a) para identificar una secuencia o secuencias homólogas; y c) Medios de recuperación para obtener dicha secuencia o secuencias homólogas de la etapa (b) .

9. Utilización del Bifidobacterium, según la reivindicación 1, o de un microorganismo que contiene una secuencia de polinucléotidos según la reivindicación 2, o un sobrenadante de los mismos para preparar un portador.

10. Utilización, según la reivindicación 9, en la que el Bifidobacterium está contenido en un portador en una cantidad 40 entre aproximadamente 105 cfu/g y aproximadamente 1012 cfu/g de material portador.

11. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en la que el portador es para la prevención y/o tratamiento de enfermedades o molestias intestinales, preferentemente la IBD (enfermedad inflamatoria intestinal) , la enfermedad de Crohn o la diarrea.

12. Utilización, según la reivindicación 11, en la que las enfermedades o molestias intestinales es provocada por bacterias patógenas y/o rotavirus.

13. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que el portador es una composición alimentaria seleccionada entre leche, yogurt, cuajada, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de 50 leche, helados, productos a base de cereales fermentados, polvos a base de leche, fórmulas infantiles, alimentos para mascotas o una composición farmacéutica seleccionada entre comprimidos, suspensiones bacterianas líquidas, suplementos orales en seco, suplementos orales húmedos, alimentación enteral por sonda en seco, o alimentación enteral por sonda húmeda.

14. Utilización, del Bifidobacterium según la reivindicación 1, para la preparación de una composición para disminuir

o prevenir la aparición de infecciones de las células intestinales por rotavirus.

15. Utilización, del Bifidobacterium según la reivindicación 1, para la preparación de una composición para prevenir

la colonización del intestino por bacterias patógenas que provocan diarrea seleccionadas entre E. coli, E. coli 60 enteropatógena, salmonella, Salmonella typhimurium.

16. Utilización, del Bifidobacterium según la reivindicación 1, para la preparación de una composición para inhibir el crecimiento de rotavirus seleccionados entre rotavirus serotipo 1, rotavirus SA-11 serotipo 3 y rotavirus Hochi serotipo 4.