Genes biosintéticos de piripiropeno A.

Un polinucleótido aislado que es

(a) un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:

266,

(b) un polinucleótido que tiene una secuencia polinucleotídica que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 267 a 274 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a las mismas,

dicha secuencia de aminoácidos equivalente tiene de 1 a 40 residuos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados comparada con SEQ ID NO: 267 a 270 y 272 a 274, y tiene la misma actividad enzimática que SEQ ID NO: 267 a 270 y 272 a 274, respectivamente, o

dicha secuencia de aminoácidos equivalente tiene de 1 a 8 residuos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados comparada con SEQ ID NO: 271, y tiene la misma actividad enzimática que SEQ ID NO: 271.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2009/063293.

Solicitante: MEIJI SEIKA PHARMA Co., LTD.

Inventor/es: YAMAMOTO, KENTARO, ANZAI, HIROYUKI, TSUCHIDA,Mariko, OYAMA,Kazuhiko, MITOMI,MASAAKI.

Fecha de Publicación: 25 de Diciembre de 2013.

Clasificación Internacional de Patentes:

C12N1/15 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
C12P17/18 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 17/00 Preparación de compuestos heterocíclicos que contienen O, N, S, Se o Te como únicos heteroátomos del ciclo (C12P 13/04 - C12P 13/24 tienen prioridad). › que contienen varios heterociclos condensados entre ellos o condensados con un sistema carbocíclico común, p. ej. rifamicina.

PDF original: ES-2453665_T3.pdf

Fragmento de la descripción:

Genes biosintéticos de piripiropeno A

Referencia cruzada respecto a solicitud relacionada Esta solicitud de patente reivindica prioridad respecto a la solicitud de patente japonesa No. 190862/2008 que se presentó el 24 de julio, 2008, la solicitud de patente japonesa No. 270294/2008 que se presentó el 20 de octubre, 2008 y la solicitud de patente japonesa No. 20591/2008 que se presentó el 30 de enero, 2009.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención La presente invención se refiere a un gen biosintético de piripiropeno A.

Antecedentes técnicos Como se divulga en la publicación de la patente japonesa accesible al público No. 360895/1992 (Documento de patente 1) y Journal of Antibiotics (1993) , 46 (7) , 1168-9 (Documento no patente 1) , el piripiropeno A tiene una actividad inhibidora contra ACAT (acil CoA colesterol aciltransferasa) . Se espera la aplicación del mismo al tratamiento de enfermedades causadas por la acumulación de colesterol o similares.

Además, en Journal of Synthetic Organic Chemistr y , Japón (1998) , Vol. 56, No. 6, 478-488 (Documento no patente 2) , documento WO94/09147 (Documento de patente 2) , publicación de la patente japonesa accesible al público No. 184158/1994 (Documento de patente 3) , publicación de la patente japonesa accesible al público No. 239385/1996 (Documento de patente 4) , publicación de la patente japonesa accesible al público No. 259569/1996 (Documento de patente 5) , publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269062/1996 (Documento de patente 6) , publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269063/1996 (Documento de patente 7) , publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269064/1996 (Documento de patente 8) , publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269065/1996 (Documento de patente 9) , publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269066/1996 (Documento de patente 10) , publicación de la patente japonesa accesible al público No. 291164/1996 (Documento de patente 11) y Journal of Antibiotics (1997) , 50 (3) , 229-36 (Documento no patente 3) , se han divulgado análogos y derivados de piripiropeno, así como actividades inhibidoras de ACAT de los mismos.

Además, Applied and Environmental Microbiology (1995) , 61 (12) , 4429-35 (documento no patente 4) ha divulgado que piripiropeno A tiene una actividad insecticida contra la larva de Heliciverpa armigera. Aún más, el documento WO2004/060065 (Documento de patente 12) ha divulgado que el piripiropeno A tiene actividades insecticidas contra la larva de la polilla de crucíferas y Tenebrio molitor.

Además, los documentos WO2006/129714 (Documento de patente 13) y WO2008/066153 (documento de patente 14) han divulgado que los análogos de piripiropeno tienen actividades insecticidas contra áfidos.

Además, como bacteria productora de piripiropeno A, se divulga la cepa FO-1289 de Aspergillus fumigatus en la publicación de la patente japonesa accesible al público No. 360895/1992 (documento de patente 1) ; la cepa NRRL3446 de Eupenicillium reticulosporum en Applied and Environmental Microbiology (1995) , 61 (12) , 4429-35 (documento no patente 4) , y la cepa F1959 de Penicillium griseofulvum en el documento WO2004/060065 (documento de patente 12) ; y la cepa PF1169 de Penicillium coprobium en Journal of Technical Disclosure 500997/2008 (documento de patente 15) .

Además, como ruta biosintética de piripiropeno A, Journal of Organic Chemistr y (1996) , 61, 882-886 (Documento no patente 5) y Chemical Review (2005) , 105, 4559-4580 (Documento no patente 6) han divulgado una putativa ruta biosintética en la cepa FO-1289 de Aspergillus fumigatus. Estos documentos han divulgado que, en la cepa FO-1289 de Aspergillus fumigatus, estructuras parciales individualmente sintetizadas por la policétido sintasa y la preniltransferasa se unen para sintetizar piripiropeno A mediante una ciclasa.

Referencias del estado de la técnica

Documentos de patente [Documento de patente 1] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 360895/1992 [Documento de patente 2] WO94/09147 [Documento de patente 3] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 184158/1994 [Documento de patente 4] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 239385/1996 [Documento de patente 5] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 259569/1996 [Documento de patente 6] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269062/1996 [Documento de patente 7] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269063/1996 [Documento de patente 8] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269064/1996 [Documento de patente 9] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269065/1996 [Documento de patente 10] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 269066/1996 [Documento de patente 11] Publicación de la patente japonesa accesible al público No. 291164/1996 [Documento de patente 12] WO2004/060065 [Documento de patente 13] WO2006/129714 [Documento de patente 14] WO2008/066153 [Documento de patente 15] Journal of Technical Disclosure 500997/2008

Documentos no patente [Documento no patente 1] Journal of Antibiotics (1993) , 46 (7) , 1168-9 [Documento no patente 2] Journal of Synthetic Organic Chemistr y , Japón (1998) , Vol. 56, No. 6, 478-488 [Documento no patente 3] Journal of Antibiotics (1997) , 50 (3) , 229-36 [Documento no patente 4] Applied and Environmental Microbiology (1995) , 61 (12) , 4429-35 [Documento no patente 5] Journal of Organic Chemistr y (1996) , 61, 882-886 [Documento no patente 6] Chemical Review (2005) , 105, 4559-4580

Compendio de la invención Los presentes inventores han encontrado ahora una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de piripiropeno A. La presente invención se ha hecho basada en tal descubrimiento.

Según esto, un objeto de la presente invención es proporcionar un polinucleótido novedoso aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de piripiropeno A, un vector recombinante que comprende el polinucleótido, y un transformante que comprende el polinucleótido.

Además, según una forma de realización de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que es

(a) un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 266,

(b) un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 266 en condiciones rigurosas, o

(c) un polinucleótido que tiene una secuencia polinucleotídica que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 267 a 274 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a las mismas.

Además, según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de (1) o (2) a continuación:

(1) una secuencia de nucleótidos en cualquiera de (a) a (h) a continuación:

(a) una secuencia de nucleótidos de 3342 a 5158 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(b) una secuencia de nucleótidos de 5382 a 12777 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(d) una secuencia de nucleótidos de 16220 a 18018 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(e) una secuencia de nucleótidos de 18506 a 19296 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(f) una secuencia de nucleótidos de 19779 a 21389 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(g) una secuencia de nucleótidos de 21793 a 22877 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(h) una secuencia de nucleótidos de 23205 a 24773 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266;

(2) una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con una secuencia de nucleótidos en (1) en condiciones rigurosas.

Además, según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de piripiropeno A.

Además, según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una o más actividades de actividad policétido sintasa, actividad preniltransferasa, actividad hidroxilasa,... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Un polinucleótido aislado que es

(a) un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 266,

(b) un polinucleótido que tiene una secuencia polinucleotídica que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 267 a 274 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a las mismas,

dicha secuencia de aminoácidos equivalente tiene de 1 a 40 residuos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados comparada con SEQ ID NO: 267 a 270 y 272 a 274, y tiene la misma actividad enzimática que SEQ ID NO: 267 a 270 y 272 a 274, respectivamente, o dicha secuencia de aminoácidos equivalente tiene de 1 a 8 residuos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados comparada con SEQ ID NO: 271, y tiene la misma actividad enzimática que SEQ ID NO: 271.

2. Un polinucleótido aislado, que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos en cualquiera de (i) a (viii) a continuación:

(i) una secuencia de nucleótidos de 3342 a 5158 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(ii) una secuencia de nucleótidos de 5382 a 12777 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(iii) una secuencia de nucleótidos de 13266 a 15144 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(iv) una secuencia de nucleótidos de 16220 a 18018 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(v) una secuencia de nucleótidos de 18506 a 19296 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(vi) una secuencia de nucleótidos de 19779 a 21389 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(vii) una secuencia de nucleótidos de 21793 a 22877 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266,

(viii) una secuencia de nucleótidos de 23205 a 24773 de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 266;

3. El polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, que codifica al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de piripiropeno A.

4. El polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, que codifica un polipéptido que tiene una o más actividades de actividad policétido sintasa, actividad preniltransferasa, actividad hidroxilasa, actividad acetiltransferasa o actividad adenilato sintetasa.

5. El polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, que deriva de la cepa PF1169 de Penicillium coprobium.

6. El polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, que codifica un polipéptido que tiene actividad para hidroxilar la posición 7 y/o la posición 13 de piripiropeno E o piripiropeno O.

7. El polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, que codifica un polipéptido que tiene actividad para hidroxilar la posición 11 de piripiropeno E.

8. Un vector recombinante que comprende uno o más de dicho polinucleótido según la reivindicación 1 o 2.

9. El vector recombinante según la reivindicación 8, que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad para hidroxilar la posición 7 y/o la posición 13 de piripiropeno E o piripiropeno O.

10. El vector recombinante según la reivindicación 8, que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad para hidroxilar la posición 11 de piripiropeno E.

11. El vector recombinante según la reivindicación 8, en donde dicho vector recombinante es un plásmido que contiene el fragmento SEQ ID NO: 266, preferiblemente el plásmido pCC1-PP1.

12. El vector recombinante según la reivindicación 8, en donde dicho vector recombinante es un plásmido que comprende los nucleótidos 13266 a 15144 de SEQ ID NO: 266, preferiblemente el plásmido pPP2.

13. El vector recombinante según la reivindicación 8, en donde dicho vector recombinante es un plásmido que comprende los nucleótidos 16220 a 18018 de SEQ ID NO: 266, preferiblemente el plásmido pPP3.

14. Un transformante no humano que comprende uno o más de dicho polinucleótido según la reivindicación 1 o 2. 5

15. El transformante según la reivindicación 14, en donde dicho transformante es Escherichia coli que comprende un plásmido que comprende el fragmento SEQ ID NO: 266, preferiblemente el plásmido pCC1-PP1.

16. El transformante según la reivindicación 14, en donde dicho transformante es Aspergillus or y zae que

comprende un plásmido que comprende los nucleótidos 13266 a 15144 de SEQ ID NO: 266, preferiblemente el plásmido pPP2.

17. El transformante según la reivindicación 14, en donde dicho transformante es Aspergillus or y zae que comprende un plásmido que comprende los nucleótidos 16220 a 18018 de SEQ ID NO: 266, preferiblemente 15 el plásmido pPP3.

18. Un método para producir un precursor de piripiropeno A, que comprende cultivar un microorganismo que comprende dichos vectores según la reivindicación 8 y aislar el precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno E.

19. Un método según la reivindicación 18, que comprende cultivar dicho transformante según la reivindicación 16 y dicho transformante según la reivindicación 17 simultáneamente o por separado, y aislar el precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno E.

20. Un método según la reivindicación 18, en donde dicho precursor de piripiropeno A está representado por la fórmula (I) a continuación:

fórmula (I)

21. Un método para producir un precursor de piripiropeno A, que comprende cultivar un microorganismo que comprende dichos vectores según la reivindicación 8 y aislar el precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno O.

22. Un método según la reivindicación 21, que comprende cultivar dicho transformante según la reivindicación 17 y aislar el precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno O.

23. Un método según la reivindicación 21, en donde dicho precursor de piripiropeno A está representado por la 40 fórmula (II) a continuación:

fórmula (II)

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