Formulación de liposomas anfóteros.

Una mezcla que comprende un oligonucleótido de ADNi de SEC ID Nº:

1251 y un liposoma anfótero, en la que elliposoma comprende:

una mezcla de componentes lipídicos con propiedades anfóteras en la que la mezcla de componentes lipídicoscomprende componentes aniónicos y catiónicos, en la que al menos uno de dichos componentes son lípidosneutros y sensibles al pH,

en la que los lípidos neutros comprenden fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas o esteroles y la mezclacontiene del 5 al 95 % molar de lípidos cargados y del 5 al 95 % de lípidos neutros.

Formulación de liposomas anfóteros La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/741.192, presentada el 1 de diciembre de 2005 y la solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/778.473, presentada el 2 de marzo de 2006, ambas de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia.

Breve descripción de la invención La invención se refiere a composiciones y procedimientos para usar las mismas para tratar cáncer. En particular, la invención se refiere a oligonucleótidos de ADNi secuestrados con liposomas anfóteros para el tratamiento de cáncer.

Antecedentes Los oncogenes se han convertido en el concepto clave para el entendimiento de la biología del cáncer y pueden proporcionar dianas valiosas para fármacos terapéuticos. En muchos tipos de tumores humanos, incluyendo linfomas y leucemias, los oncogenes están sobreexpresados, y pueden asociarse con tumorigenicidad (Tsujimoto y col., Science 228: 1440-1443 (1985) ) . Por ejemplo, se han descubierto altos niveles de expresión del gen bcl-2 humano en todos los linfomas con una traslocación cromosómica t (14; 18) incluyendo la mayoría de los linfomas de linfocitos B foliculares y muchos linfomas no de Hodgkin de células grandes. También se han descubierto altos niveles de expresión del gen bcl-2 en ciertas leucemias que no tienen una traslocación cromosómica t (14; 18) , incluyendo la mayoría de los casos de leucemia linfocítica crónica aguda, muchas leucemias linfocíticas del tipo prelinfocitos B, neuroblastomas, carcinomas nasofaríngeos y muchos adenocarcinomas de la próstata, mama y colon (Reed y col., Cancer Res. 51: 6529 [1991]; Yunis y col., New England J. Med. 320: 1047; Campos y col., Blood

81: 3091-3096 [1993]; McDonnell y col., Cancer Res. 52: 6940-6944 [1992]; Lu y col., Int. J Cancer 53: 29-35 [1993]; Bonner y col., Lab Invest. 68: 43A [1993]) . Otros oncogenes incluyen TGF-α, c-ki-ras, ras, Her-2 y c-myc.

La expresión de oncogenes puede inhibirse por oligonucleótidos de ADNi monocatenarios. Los productos terapéuticos de ácido nucleico, sin embargo, carecen con frecuencia de eficacia terapéutica debido a la inestabilidad en los fluidos corporales o captación ineficaz en células.

Existe por lo tanto una necesidad de un suministro estable y eficaz de dichos oligonucleótidos de ADNi en fluidos corporales y células para tratamiento del cáncer. El documento WO 02/092617 A1 enseña un tratamiento combinado de cáncer por una combinación de un oligómero antisentido con c-myc y un agente quimioterapéutico convencional. El oligómero antisentido puede dirigirse a un iniciador o sitio promotor de c-myc. El documento WO 98/14172 A2 sugiere oligonucleótidos antisentido y polinucleótidos dirigidos a parte de los genes bcl-2 y su uso en el tratamiento del cáncer. Las construcciones antisentido pueden diseñarse para unirse al promotor y otras regiones de control del gen. El documento WO 95/08350 A1 describe oligómeros antisentido y procedimientos para usarlos para controlar el crecimiento de células cancerosas que expresan el gen bcl-2. El documento WO 2004/056971 A2 sugiere el uso de oligómeros antisentido de bcl-2 para tratar y prevenir trastornos relacionados con bcl-2 tales como cánceres, tumores, carcinomas y trastornos relacionados con proliferación de células. El documento se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más oligómeros antisentido de bcl-2, que pueden comprender uno o más agentes terapéuticos de cáncer.

Sumario de la invención La invención proporcionar una mezcla que comprende un oligonucleótido de ADNi de SEC ID Nº: 1251 y un liposoma anfótero, en el que el liposoma comprende una mezcla de componentes lipídicos con propiedades anfóteras, en el que la mezcla de componentes lipídicos comprende componentes aniónicos y catiónicos, en el que al menos uno de dichos componentes es sensible a pH y lípidos neutros, en los que los lípidos neutros comprenden fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas o esteroles y la mezcla contiene del 5 al 95 % molar de lípidos cargados y del 5 al 95 % de lípidos neutros.

La invención proporciona además una mezcla que comprende un liposoma anfótero y un oligonucleótido de ADNi que comprende SEC ID Nº: 1251 o 1250 o el complemento del mismo en la que el liposoma comprende POPC, DOPE, MoChol y CHEMS en la relación molar de POPC/DOPE/MoChol/CHEMS de 6/24/47/23 o 15/45/20/20.

Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las mezclas anteriores.

Además, la invención proporciona un procedimiento in vitro para introducir un oligonucleótido de ADNi en una células que comprende poner en contacto la célula con cualquiera de las mezclas anteriores, en el que la introducción de las composiciones da como resultado una reducción de proliferación de la célula o induce muerte celular.

Dichos liposomas anfóteros pueden, por ejemplo, tener una carga aniónica o neutra a pH fisiológico y una carga catiónica a un pH ácido de aproximadamente 4. Ventajosamente, las composiciones de la presente invención secuestran grandes cantidades de oligonucleótidos de ADNi, entre aproximadamente 1 y 4 mg/ml (por ejemplo, aproximadamente 2 mg/ml) a una concentración de lípidos de aproximadamente 10 a 100 mM o menos; muestran estabilidad coloidal y en suero; captación potenciada en células y tumores debido a tamaños de liposoma medios de menos de 200 nm; y baja toxicidad en relación con liposomas formados con lípidos catiónicos que se usan en reactivos de transfección convencionales.

En un primer aspecto, la invención proporciona una mezcla que comprende liposomas anfóteros y un oligonucleótido de ADNi. En una realización del primer aspecto, los liposomas anfóteros tienen un punto isoeléctrico de entre 4 y 8. En una realización adicional, los liposomas anfóteros están cargados negativamente o son neutros a pH 7, 4 y están cargados positivamente a pH 4.

En otra realización del primer aspecto, los liposomas anfóteros incluyen lípidos anfóteros. En una realización adicional, los lípidos anfóteros pueden ser HistChol, HistDG, isoHistSucc DG, Acilcarnosina, HCChol o combinaciones de los mismos. En otra realización, los liposomas anfóteros incluyen una mezcla de uno o más lípidos catiónicos y uno o más lípidos aniónicos. En otra realización más, los lípidos catiónicos pueden ser DMTAP, DPTAP, DOTAP, DC-Chol, MoChol o HisChol, o combinaciones de los mismos, y los lípidos aniónicos pueden ser CHEMS, DGSucc, Cet-P, DMGSucc, DOGSucc, POGSucc, DPGSucc, DG Succ, DMPS, DPPS, DOPS, POPS, DMPG, DPPG, DOPG, POPG, DMPA, DPPA, DOPA, POPA o combinaciones de los mismos.

En otra realización más, los liposomas también incluyen lípidos neutros. En una realización adicional, los lípidos neutros incluyen esteroles y derivados de los mismos. En una realización adicional más, los esteroles comprenden colesteroles y derivados de los mismos. Los lípidos neutros también pueden incluir fosfolípidos neutros. En una realización, los fosfolípidos incluyen fosfatidilcolinas o fosfatidilcolinas y fosfoetanolaminas. En otra realización, las fosfatidilcolinas son POPC, OPPC, PC de soja hidrogenada o natural, PC de huevo hidrogenada o natural, DMPC, DPPC o DOPC y derivados de los mismos y las fosfatidiletanolaminas son DOPE, DMPE, DPPE o derivados y combinaciones de los mismos. En una realización adicional, la fosfatidilcolina es POPC, OPPC, PC de soja o PC de huevo y las fosfatidiletanolaminas son DOPE.

En una realización adicional más, los lípidos de los liposomas anfóteros incluyen DOPE, POPC, CHEMS y MoChol; POPC, Chol, CHEMS y DOTAP; POPC, Chol, Cet-P y MoChol, o POPC, DOPE, MoChol y DMGSucc.

En un segundo aspecto, los liposomas anfóteros de la mezcla de la invención pueden formarse a partir de una fase lipídica que comprende una mezcla de componentes lipídicos con propiedades anfóteras, en la que la cantidad total de lípidos cargados en el liposoma puede variar del 5 % molar al 70 % molar, la cantidad total de lípidos neutros puede variar del 20 % molar al 70 % molar, y un oligonucleótido de ADNi. En una realización del primer aspecto, los liposomas anfóteros incluyen del 3 al 20 % molar de POPC, del 10 al 60 % molar de DOPE, del 10 al 60 % molar de MoChol y del 10 al 50 % molar de CHEMS. En una realización adicional, los liposomas incluyen POPC, DOPE, MoChol y CHEMS en las relaciones molares de POPC/DOPE/MoChol/CHEMS de aproximadamente 6/24/47/23 o 15/45/20/20. En otra realización más, los liposomas incluyen del 3 al 20 % molar de POPC, del 10 al 40 % molar de DOPE, del 15 al 60 % molar de MoChol y del 15 al 60 % molar de DMGSucc. En una realización adicional,... [Seguir leyendo]

1. Una mezcla que comprende un oligonucleótido de ADNi de SEC ID Nº: 1251 y un liposoma anfótero, en la que el liposoma comprende:

una mezcla de componentes lipídicos con propiedades anfóteras en la que la mezcla de componentes lipídicos comprende componentes aniónicos y catiónicos, en la que al menos uno de dichos componentes son lípidos neutros y sensibles al pH, en la que los lípidos neutros comprenden fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas o esteroles y la mezcla contiene del 5 al 95 % molar de lípidos cargados y del 5 al 95 % de lípidos neutros.

2. La mezcla de la reivindicación 1 en la que la mezcla contiene del 20 al 80 % molar de lípidos cargados y del 20 al 10 80 % de lípidos neutros.

3. La mezcla de la reivindicación 1 en la que la mezcla contiene del 30 al 70 % molar de lípidos cargados y del 30 al 70 % de lípidos neutros.

4. La mezcla de la reivindicación 1 en la que la mezcla contiene del 30 al 70 % molar de lípidos cargados y del 30 al 60 % de lípidos neutros.

5. Una mezcla que comprende un liposoma anfótero y un oligonucleótido de ADNi que comprende SEC ID Nº: 1251

o 1250 o el complemento del mismo, en la que el liposoma comprende POPC, DOPE, MoChol y CHEMS en la relación molar de POPC/DOPE/MoChol/CHEMS de 6/24/47/23 o 15/45/20/20.

6. Una composición farmacéutica que comprende la mezcla de las reivindicaciones 1 a 5.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6 que comprende un oligonucleótido de ADNi que comprende

SEC ID Nº: 1251 o 1250 y un liposoma que comprende POPC, DOPE, MoChol y CHEMS en la relación molar de POPC/DOPE/MoChol/CHEMS de 6/24/47/23.

8. Un procedimiento in vitro para introducir un oligonucleótido de ADNi en una célula que comprende poner en contacto la célula con la mezcla de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la introducción de la composición da como resultado una reducción de la proliferación de la célula, o induce muerte celular.

9. La mezcla de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la composición farmacéutica de las reivindicaciones 6 y 7 para su uso en el tratamiento del cáncer.