Fitasa de citrobacter freundii y homólogos.

Un polipéptido de fitasa aislado que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID Nº:

3correspondiente a fitasa de Citrobacter freundii o una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad (homología)con la misma; en el que dicho polipéptido comprende una combinación de mutaciones seleccionada del grupo queconsiste en: R288M; K46E/Q82H/E168D/Q274L; Q82K/T154I/Q279E/N308T; Q82R/D112V/Q274H/T362A;

D53N/D57Y/T199I/P229S/R288M; K46E/Q82H/N148D/T154I/T362I; D53N/D57Y/P229S/R288M/K358R;

D53N/D57Y/T154I/P229S/R288M; K46E/Q82H/N95D/D112V/K142R/D383V;

D53N/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P; D53K/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P;

D53N/D57Y/F88Y/M152V/P229S/Q279E/N308T; D53N/D57Y/M152V/E204V/P229S/R288M/A393P;

D53N/D57Y/M152V/T154I/P229S/R288M/A393P; D53N/D57Y/Q82H/G103E/M152V/P229S/R288M/A393P;

K46E/D53N/D57Y/T143I/M152V/L176V/P229S/R288M/A393P;

Q82K/F88Y/N96P/Q97T/T98G/V105I/Q274H/Q279E/A393P;

Q82R/F88Y/N95P/N96P/Q97T/Q279E/I384L/P386Q/A393P;

H18Q/D53N/D57Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R288M/Q385R/A393P;

Q82K/F88Y/N96P/T98G/Y136N/M152V/Y177F/T362I/I384F/A393P/D397N;

D53N/D57Y/F88Y/N95P/N96P/V105I/D112V/Y136N/N148D/N164D/Q274H/T362I/I384L/A393P;

D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N95P/P102L/V105I/Y136N/N148D/Y177F/Q274H/Q279E/T362I/A393P;

D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N96P/T98G/V105I/D112V/Y177F/Q274L/G343A/T362I/I384L/A393P; E23K/K46E/Q82H;

K46E/Q82H/Q385R; D53N/D57Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R288M/Q385R/A393P;

numeradas según la numeración en SEC ID Nº. 3, y en el que el polipéptido aislado tiene elevada termoestabilidaden comparación con un polipéptido que tiene la secuencia explicada en SEC ID Nº: 3.

Fitasa de citrobacter freundii y homólogos La presente invención se refiere a fitasas, secuencias de nucleótidos para las mismas, procedimientos de producción de fitasas y a su uso.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de enzimas para aditivos a piensos. Más específicamente, la presente invención se refiere a fitasas que pueden usarse para potenciar la digestión de fosfato en alimentos y piensos animales.

ANTECEDENTES TÉCNICOS Y TÉCNICA ANTERIOR

El fitato es la principal forma de almacenamiento de fósforo en cereales y legumbres. Sin embargo, los animales monogástricos tales como cerdos, aves de corral y pescado no pueden metabolizar o absorber el fitato (o ácido fítico) y, por tanto, es secretado conduciendo a la polución fosforosa de áreas de intensa producción ganadera. Además, el ácido fítico también actúa de agente antinutritivo en animales monogástricos quelando agentes metálicos tales como calcio, cobre y cinc.

Con el fin de proporcionar fosfatos suficientes para el crecimiento y la salud de estos animales, a sus dietas se añade fosfato inorgánico. Tal adición puede ser costosa y además aumenta los problemas de polución.

El fitato es convertido por fitasas que generalmente catalizan la hidrólisis del fitato a fosfatos de inositol inferiores y fosfato orgánico. Las fitasas son útiles como aditivos para piensos animales en los que mejoran la disponibilidad de fósforo orgánico para el animal y disminuyen la polución de fosfato del entorno (Wodzinski RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996) ) .

En la bibliografía se han descrito varias fitasas de origen fúngico (Wyss M. y col. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2) , 367-373 (1999) ; Berka R.M. y col. Appl. Environ. Microbiol. 64 (11) , 4423-4427 (1998) ; Lassen S. y col. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10) , 4701-4707 (2001) ) y bacteriano (Greiner R. y col. Arch. Biochem. Biophys. 303 (1) , 107113 (1993) ; Kerovuo y col. Appl. Environ. Microbiol. 64 (6) , 2079-2085 (1998) ; Kim H.W. y col. Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003) ; Greiner R. y col. Arch. Biochem. Biophys. 341 (2) , 201-206 (1997) ; Yoon S.J. y col. Enzyme and microbial technol. 18, 449-454 (1996) ; Zinin N.V. y col. FEMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004) ) ) .

Sin embargo, hasta la fecha, ninguna de estas fitasas ha mostrado las propiedades requeridas para el uso eficaz como suplemento para piensos animales. En particular, las fitasas fúngicas tienden a ser proteolíticamente inestables (Igbasan F.A. y col. Arch. Anim. Nutr. 53, 353-373 (2000) ) y, por tanto, susceptibles a degradación, mientras que la mayoría de las fitasas bacterianas tienen una estrecha especificidad de sustrato por el fitato solo y degradan escasamente los fosfatos de inositol de grados intermedios de fosforilación (Greiner R. y col., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1) , 107-113 (1993) ; Kerovuo J y col. Biochem. J. 352, 623-628 (2000) ) .

Por consiguiente, existe la necesidad de fitasas mejoradas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un amplio aspecto, la presente invención se refiere a fitasas derivadas de una bacteria y formas modificadas de la misma. En particular, la invención se refiere a fitasas naturales derivadas de la bacteria Citrobacter freundii y a formas variantes/modificadas de las mismas que muestran características mejoradas con respecto a la enzima natural.

La presente invención es ventajosa, ya que proporciona fitasas novedosas que tienen propiedades que las hacen particularmente útiles y eficientes como enzimas para pienso. En particular, la invención se refiere a polipéptido de fitasa novedoso aislado y/o purificado como se describe en el presente documento o fragmentos o variantes funcionales o formas modificadas del mismo. La invención también proporciona las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos que codifican dichas fitasas.

Para ser eficiente como aditivo de enzima para alimento o pienso animal, una fitasa tiene que combinar varias propiedades diferentes. Con el fin de poder degradar el ácido fítico en el entorno ácido de un estómago de animal tiene que ser activo a bajo pH, preferentemente durante un amplio intervalo de valores de pH. Además, tiene que tener alta actividad específica y preferentemente alta termoestabilidad para permitir que la proteína resista a las altas temperaturas comúnmente usadas en la preparación de piensos tales como gránulos de pienso.

También es importante que la enzima tenga amplia especificidad por sustrato que permite que se hidrolice no sólo el fitato, sino también productos intermedios de la degradación del fitato tales como pentafosfatos, tetrafosfatos y trifosfatos de inositol. Estudios sobre la degradación del fitato en cerdos muestran que estos oligofosfatos de inositol

siguen siendo por lo demás ampliamente insolubles en el intestino delgado y grueso y, por tanto, inaccesibles a fosfatasas alcalinas producidas por el animal y la microflora intestinal (Schlemmer U. y col. Arch. Anim. Nutr. 55, 255-280 (2001) ) . Se han identificado variaciones en los perfiles de especificidad del sustrato de diferentes enzimas. Por ejemplo, los trifosfatos de inositol generados por la fitasa de B. subtilis son esencialmente resistentes a la posterior hidrólisis por esta enzima (Kerovuo J. y col. Biochem J. (200) 352, 623-628) .

En otro aspecto de la invención se proporciona un plásmido o un sistema de vector o un organismo transformado o transgénico que comprende una fitasa novedosa como se describe en el presente documento o una forma modificada del mismo.

En otro aspecto la presente invención se refiere a organismos transgénicos modificados para expresar una fitasa novedosa como se describe en el presente documento o una forma modificada de la misma y que, por tanto, pueden producir una fitasa. La presente invención proporciona además medios y procedimientos para la producción biotecnológica de fitasas y su uso como suplementos para piensos.

Los aspectos de la presente invención se presentan en las reivindicaciones y en el siguiente comentario.

Para facilidad de referencia, estos y otros aspectos de la presente invención se tratan ahora bajo encabezamientos de sección apropiados. Sin embargo, las enseñanzas bajo cada sección no están necesariamente limitadas a cada sección particular.

Como se usa con referencia a la presente invención, los términos “producen”, “producir”, “producido”, “producible”, “producción” son sinónimos a los términos respectivos “preparar”, “preparando”, “preparado”, “preparación”, “generado”, “generación” y “preparable”.

Como se usa con referencia a la presente invención, los términos “expresión”, “expresa”, “expresado” y “expresable” son sinónimos a los términos respectivos “transcripción”, “transcribe”, “transcrito” y “transcribible”.

Como se usa con referencia a la presente invención, los términos “transformación” y “transfección” se refieren a un procedimiento de introducción de secuencias de ácidos nucleicos en huéspedes, células huésped, tejidos u órganos.

Otros aspectos referentes a las secuencias de nucleótidos que pueden usarse en la presente invención incluyen: una construcción que comprende las secuencias de la presente invención; un vector que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; un plásmido que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; una célula transformada que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; un tejido transformado que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; un órgano transformado que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; un huésped transformado que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; un organismo transformado que comprende las secuencias para su uso en la presente invención. La presente invención también engloba procedimientos de expresión de la secuencia de nucleótidos para su uso en la presente invención usando los mismos, tales como expresión en una célula huésped; que incluyen procedimientos para transferir la misma. La presente invención engloba adicionalmente procedimientos de aislamiento de la secuencia de nucleótidos, tales como aislamiento de una célula huésped.

Otros aspectos referentes a las secuencias de aminoácidos para su uso en la presente invención incluyen: una construcción que codifica las secuencias de aminoácidos para su uso en la presente... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de fitasa aislado que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID Nº: 3 correspondiente a fitasa de Citrobacter freundii o una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad (homología) con la misma; en el que dicho polipéptido comprende una combinación de mutaciones seleccionada del grupo que consiste en: R288M; K46E/Q82H/E168D/Q274L; Q82K/T154I/Q279E/N308T; Q82R/D112V/Q274H/T362A; D53N/D57Y/T199I/P229S/R288M; K46E/Q82H/N148D/T154I/T362I; D53N/D57Y/P229S/R288M/K358R; D53N/D57Y/T154I/P229S/R288M; K46E/Q82H/N95D/D112V/K142R/D383V; D53N/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P; D53K/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P; D53N/D57Y/F88Y/M152V/P229S/Q279E/N308T; D53N/D57Y/M152V/E204V/P229S/R288M/A393P; D53N/D57Y/M152V/T154I/P229S/R288M/A393P; D53N/D57Y/Q82H/G103E/M152V/P229S/R288M/A393P; K46E/D53N/D57Y/T143I/M152V/L176V/P229S/R288M/A393P; Q82K/F88Y/N96P/Q97T/T98G/V105I/Q274H/Q279E/A393P; Q82R/F88Y/N95P/N96P/Q97T/Q279E/I384L/P386Q/A393P; H18Q/D53N/D57Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R288M/Q385R/A393P; Q82K/F88Y/N96P/T98G/Y136N/M152V/Y177F/T362I/I384F/A393P/D397N; D53N/D57Y/F88Y/N95P/N96P/V105I/D112V/Y136N/N148D/N164D/Q274H/T362I/I384L/A393P; D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N95P/P102L/V105I/Y136N/N148D/Y177F/Q274H/Q279E/T362I/A393P; D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N96P/T98G/V105I/D112V/Y177F/Q274L/G343A/T362I/I384L/A393P; E23K/K46E/Q82H; K46E/Q82H/Q385R; D53N/D57Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R288M/Q385R/A393P;

numeradas según la numeración en SEC ID Nº. 3, y en el que el polipéptido aislado tiene elevada termoestabilidad en comparación con un polipéptido que tiene la secuencia explicada en SEC ID Nº: 3.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido según la reivindicación 1.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 2 que codifica el polipéptido aislado o fitasa según la reivindicación 1.

4. Un plásmido o sistema de vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido aislado o fitasa según la reivindicación 1.

5. Un plásmido o sistema de vector según la reivindicación 4 que comprende una secuencia de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3.

6. Un plásmido o sistema de vector según las reivindicaciones 4 ó 5 en el que dicho plásmido o sistema de vector es un vector de expresión para la expresión del polipéptido aislado o enzima fitasa en una célula huésped o un microorganismo.

7. Una célula huésped transformada o transfectada con un plásmido o sistema de vector según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Una célula huésped según la reivindicación 7 en el que dicha célula huésped se deriva de un microorganismo que incluye bacterias tales como B. subtilis, E. coli y hongos que incluyen levadura tal como H. polymorpha, S. pombe, S. cerevisiae.

9. Una célula huésped según la reivindicación 8, en el que dicho microorganismo es una célula bacteriana procariota y preferentemente E. coli.

10. Un procedimiento de producción de una fitasa que comprende expresar una secuencia de aminoácidos como se explica en SEC ID Nº: 3, o una secuencia que tiene al menos el 90% de homología con la misma, en una célula huésped y separar la fitasa del medio de cultivo de células huésped, en el que dichas secuencias de aminoácidos comprenden una mutación seleccionada del grupo explicado en la reivindicación 1 o una combinación de mutaciones seleccionada del grupo explicado en la reivindicación 1 y en el que la fitasa tiene elevada termoestabilidad en comparación con un polipéptido que tiene la secuencia explicada en SEC ID Nº: 3.

11. Una composición de alimento o de pienso animal que comprende un polipéptido como se define en la reivindicación 1.

12. Uso de un polipéptido o fitasa según la reivindicación 11 en alimento o pienso animal.

13. Un procedimiento para la producción de alimento o pienso animal que comprende una etapa de pulverizar un polipéptido o fitasa según la reivindicación 11 en forma líquida sobre dicho alimento o pienso animal, y/o que comprende una etapa de mezclar el polipéptido o fitasa según la reivindicación 11 como producto seco con dicho alimento o pienso animal.

14. Un procedimiento de cribado de una variante de enzima fitasa, procedimiento que comprende:

a) seleccionar una enzima fitasa parental, en el que la enzima fitasa parental es una enzima fitasa parental con al menos el 90% de homología con SEC ID Nº 3;

b) hacer al menos una alteración en la enzima fitasa parental para obtener una variante de enzima fitasa según la reivindicación 1; y

c) cribar una variante de enzima fitasa que en comparación con la enzima fitasa parental tiene mayor estabilidad térmica y:

i. mayor actividad específica; y/o ii. mayor estabilidad proteolítica.

15. Un procedimiento de cribado de una variante de enzima fitasa, procedimiento que comprende:

a) someter la secuencia de ADN que codifica una enzima fitasa parental a mutagénesis para obtener una variante de enzima fitasa según la reivindicación 1, en el que la enzima fitasa parental es una enzima fitasa parental con al menos el 90% de homología con SEC ID Nº 3;

b) expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en la etapa a) en una célula huésped; y

c) cribar células huésped que expresan una variante de enzima fitasa que en comparación con la enzima fitasa parental tiene mayor estabilidad térmica y:

i. mayor actividad específica; y/o ii. mayor estabilidad proteolítica.

16. Un procedimiento de preparación de una variante de enzima fitasa, procedimiento que comprende:

a) seleccionar una enzima fitasa parental, en el que la enzima fitasa parental es una enzima fitasa parental con al menos el 90% de homología con SEC ID Nº 3; b) hacer al menos una alteración en la enzima fitasa parental para obtener una variante de enzima fitasa según la reivindicación 1; y c) preparar la variante de enzima fitasa.

17. Un procedimiento de preparación de una variante de enzima fitasa, procedimiento que comprende: a) someter la secuencia de ADN que codifica una enzima fitasa parental a mutagénesis para obtener una

variante de enzima fitasa según la reivindicación 1, en el que la enzima fitasa parental es una enzima fitasa parental con al menos el 90% de homología con SEC ID Nº 3; b) expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en la etapa a) en una célula huésped; y c) preparar la variante de enzima fitasa expresada por la célula huésped.

18. Un polipéptido de fitasa aislado según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 95% de identidad (homología) con SEC ID Nº: 3.

19. Un polipéptido de fitasa aislado según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 96% de identidad (homología) con SEC ID Nº: 3.

20. Un polipéptido de fitasa aislado según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 97% de identidad (homología) con SEC ID Nº: 3.

21. Un polipéptido de fitasa aislado según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 98% de identidad (homología) con SEC ID Nº: 3.

22. Un polipéptido de fitasa aislado según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 99% de identidad (homología) con SEC ID Nº: 3.