Filtración de flujo tangencial variable.

Método para concentrar una solución de inmunoglobulina mediante filtración de flujo tangencial,

caracterizadoporque la presión transmembranal y el flujo transversal son variables y se modifican durante el procedimiento defiltración según la concentración de inmunoglobulina, con:

a) presión transmembranal de entre 1,4 bar y 1,6 bar y un flujo transversal de entre 75 ml/min y 90 ml/min en unintervalo de concentraciones de hasta 30 mg de inmunoglobulina por ml de solución que debe concentrarse,

b) presión transmembranal de entre 0,8 bar y 0,9 bar y un flujo transversal de entre 140 ml/min y 160 ml/min enun intervalo de concentraciones de entre 15 mg/ml y 55 mg/ml,

c) presión transmembranal de entre 0,8 bar y 0,9 bar y un flujo transversal de entre 120 ml/min y 140 ml/min enun intervalo de concentraciones de entre 50 mg/ml y 275 mg/ml,

en el que la concentración real de la inmunoglobulina en la solución que debe concentrarse determina la presióntransmembranal aplicada y el flujo cruzado, y se ajustan la presión transmembranal y el flujo transversal según laconcentración real de la inmunoglobulina.

Filtración de flujo tangencial variable La presente invención se encuentra comprendida en el campo de la concentración de proteínas; más concretamente, se refiere a la utilización de la filtración de flujo tangencial (FFT) para la concentración de inmunoglobulinas.

Antecedentes de la invención Las proteínas y especialmente las inmunoglobulinas desempeñan un papel importante en la cartera médica actual. Los sistemas de expresión para la producción de polipéptidos recombinantes son bien conocidos del estado de la técnica y han sido descritos en, por ejemplo, Marino M.H., Biopharm. 2:18-33, 1989; Goeddel D.V. et al., Methods Enzymol. 185:3-7, 1990; Wurm F. y Bernard A., Curr. Opin. Biotechnol. 10:156-159, 1999. Los polipéptidos para la utilización en aplicaciones farmacéuticas se producen principalmente en células de mamífero tales como células CHO, células NS0, células Sp2/0, células COS, células HEK, células BHK, células PER.C6® y similares.

Para la aplicación humana cada sustancia farmacéutica debe cumplir unos criterios definidos. Para garantizar la seguridad de los agentes biofarmacéuticos para el ser humano, por ejemplo ácidos nucleicos, virus y proteínas de la célula huésped, que provocarían daños severos, deben ser eliminados. Para cumplir la norma reguladora, deben llevarse a cabo una o más etapas de purificación después del procedimiento de fabricación. Entre otros, la pureza, la producción y el rendimiento desempeñan un papel importante en la determinación de un procedimiento de purificación apropiada.

Debido a sus propiedades químicas y físicas, tales como el peso molecular y la arquitectura de dominios, incluyendo las modificaciones secundarias, el procesamiento posterior de las inmunoglobulinas resulta muy complicado. Por ejemplo, no sólo para fármacos formulados, sino también para intermediarios en el procesamiento posterior de recuperación y purificación (DSP) , se requieren soluciones concentradas para conseguir volúmenes pequeños para una manipulación económica y el almacenamiento de aplicaciones. Además, resultan favorables los tiempos de concentración cortos para garantizar procedimientos limpios y tiempos operativos cortos. En este contexto, los procedimientos TFF imperfectos, especialmente tras las etapas de purificación finales, pueden provocar daños sostenidos, afectando incluso al producto farmacológico. La correlación entre el esfuerzo de cizalladura y la agregación en los procedimientos de concentración de flujo tangencial para soluciones de intermediarios de anticuerpos monoclonales (mAb) ha sido investigada por Ahrer K. et al. (J. Membr. Sci. 274:108-115, 2006) . Se ha realizado un seguimiento de la influencia del tiempo de concentración y flujos y presiones seleccionados sobre el rendimiento del procedimiento y el estado de agregación (ver, por ejemplo, Dosmar M. et al., Bioprocess Int. 3:4050, 2005; Luo R. et al., Bioprocess Int. 4:44-46, 2006) .

Mahler H. C. et al. (Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 59:407-417, 2005) informan de la inducción y análisis de agregados en una formulación líquida de anticuerpo de IgG1 formada mediante diferentes métodos de estrés de agitación. En la patente US nº 6.252.055 se informa de una preparación concentrada de anticuerpo monoclonal. Se publica un método para la producción de una preparación concentrada de anticuerpo en la patente US nº 2006/0182740. Se publica un procedimiento combinado de ultrafiltración, diafiltración y segunda secuencia de ultrafiltración en la patente US nº 2006/0051347. En la patente EP nº 0 907 378 se publica un procedimiento para la concentración de una preparación de anticuerpo utilizando una ultrafiltración de flujo transversal con una tasa de recirculación fija de 250 ml/min. Los métodos para la filtración de flujo tangencial y un aparato para los mismos se publican en la patente US nº 2004/0167320. En la solicitud de patente WO nº 97/45140 se informa de una solución concentrada de anticuerpo.

Descripción resumida de la invención La presente invención proporciona un método para la concentración de soluciones que contienen inmunoglobulinas producidas recombinantemente.

En mayor detalle, un aspecto de la presente invención es un método para concentrar una solución de inmunoglobulina mediante filtración de flujo tangencial, en la que la presión transmembranal y el flujo transversal que se aplican son variables, con una:

a) presión transmembranal de entre 1, 4 bar y 1, 6 bar y un flujo transversal de entre 75 ml/min y 90 ml/min en un intervalo de concentraciones de hasta 30 mg de inmunoglobulina por ml de solución que debe concentrarse,

b) presión transmembranal de entre 0, 8 bar y 0, 9 bar y un flujo transversal de entre 140 ml/min y 160 ml/min en un intervalo de concentraciones de entre 15 mg/ml y 55 mg/ml, y

c) presión transmembranal de entre 0, 8 bar y 0, 9 bar y un flujo transversal de entre 120 ml/min y 140 ml/min en un intervalo de concentraciones de entre 50 mg/ml y 275 mg/ml,

en el que la concentración real de la inmunoglobulina en la solución que debe concentrarse determina la presión transmembranal aplicada y el flujo cruzado, y se ajustan la presión transmembranal y el flujo transversal según la concentración real de la inmunoglobulina.

En una realización preferente, el intervalo de concentraciones en la etapa c) es de entre 50 mg/ml y 180 mg/ml. En una realización más preferente, el intervalo de concentraciones en la etapa c) es de entre 50 mg/ml y 130 mg/ml. En otra realización, la presión transmembranal y el flujo transversal son de 1, 5 bar y 80 ml/min. en la etapa a) , de 0, 85 bar y 150 ml/min. en la etapa b) y/o de 0, 85 bar y 130 ml/min en la etapa c) . En otra realización, la solución de inmunoglobulina es una solución acuosa y tamponada de inmunoglobulina.

Otro aspecto de la presente invención es un método para la producción de una inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero, que comprende las etapas siguientes en este orden:

a) proporcionar una célula de mamífero recombinante que comprende uno o más ácidos nucleicos codificantes de una inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero,

b) cultivar la célula de la etapa a) bajo condiciones adecuadas para la expresión de la inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero,

c) recuperar la inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero, a partir de la célula de mamífero recombinante o del medio de cultivo,

d) concentrar la solución acuosa tamponada obtenida, que comprende la inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero utilizando una filtración de flujo tangencial con presión transmembranal y flujo transversal variables.

En una realización, la etapa d) del método comprende concentrar la solución acuosa tamponada obtenida utilizando una filtración de flujo tangencial con presión transmembranal y flujo transversal variables, con:

i) una presión transmembranal de entre 1, 4 bar y 1, 6 bar y un flujo transversal de entre 75 ml/min y 90 ml/min en un intervalo de concentraciones de hasta 30 mg de inmunoglobulina por ml de solución que debe concentrarse,

ii) una presión transmembranal de entre 0, 8 bar y 0, 9 bar y un flujo transversal de entre 140 ml/min y 160 ml/min en un intervalo de concentraciones de entre 15 mg/ml y 55 mg/ml, y

iii) una presión transmembranal de entre 0, 8 bar y 0, 9 bar y un flujo transversal de entre 120 ml/min y 140 ml/min en un intervalo de concentraciones de más de 45 mg/ml.

En otra realización, el método comprende antes de la etapa d) o después de la etapa d) la etapa siguiente:

e) purificar la solución acuosa tamponada que contiene la inmunoglobulina, la cual no es producida naturalmente por una célula de mamífero.

En otra realización, la inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero es una inmunoglobulina completa, o un fragmento de inmunoglobulina, o un conjugado de inmunoglobulina. En una realización, la célula de mamífero es una célula CHO, una célula HEK, una célula NS0, una célula Sp2/0, una célula COS, una célula HEK o una célula PER.C6®.

Descripción detallada de la invención La presente invención publica un método para la concentración de soluciones de inmunoglobulina hasta una concentración superior a 100 mg/ml. Inesperadamente se ha encontrado que con un método según la invención puede conseguirse lo anterior con una formación de agregados reducida y en un tiempo corto.

Las expresiones "filtración de flujo tangencial" o "FFT", las cuales se utilizan intercambiablemente... [Seguir leyendo]

1. Método para concentrar una solución de inmunoglobulina mediante filtración de flujo tangencial, caracterizado porque la presión transmembranal y el flujo transversal son variables y se modifican durante el procedimiento de filtración según la concentración de inmunoglobulina, con:

a) presión transmembranal de entre 1, 4 bar y 1, 6 bar y un flujo transversal de entre 75 ml/min y 90 ml/min en un intervalo de concentraciones de hasta 30 mg de inmunoglobulina por ml de solución que debe concentrarse, b) presión transmembranal de entre 0, 8 bar y 0, 9 bar y un flujo transversal de entre 140 ml/min y 160 ml/min en un intervalo de concentraciones de entre 15 mg/ml y 55 mg/ml, c) presión transmembranal de entre 0, 8 bar y 0, 9 bar y un flujo transversal de entre 120 ml/min y 140 ml/min en un intervalo de concentraciones de entre 50 mg/ml y 275 mg/ml,

en el que la concentración real de la inmunoglobulina en la solución que debe concentrarse determina la presión transmembranal aplicada y el flujo cruzado, y se ajustan la presión transmembranal y el flujo transversal según la concentración real de la inmunoglobulina.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la presión transmembranal y el flujo transversal son: -1, 5 bar y 80 ml/min. en la etapa a) , - 0, 85 bar y 150 ml/min. en la etapa b) y/o - 0, 85 bar y 130 ml/min en la etapa c) .

3. Método para producir una inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero, que

comprende las etapas siguientes: a) proporcionar una célula de mamífero recombinante que comprende uno o más ácidos nucleicos codificantes de una inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero, b) cultivar dicha célula bajo condiciones adecuadas para la expresión de la inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero, c) recuperar la inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero, a partir de la célula de mamífero recombinante o del medio de cultivo, d) concentrar la solución acuosa tamponada obtenida, que comprende la inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero utilizando una filtración de flujo tangencial con presión transmembranal y flujo transversal variables según la reivindicación 1.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque comprende, antes o después de la etapa d) , la etapa

siguiente: e) purificar la solución acuosa tamponada que contiene la inmunoglobulina, la cual no es producida naturalmente por una célula de mamífero.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una célula de mamífero es una inmunoglobulina completa, o un fragmento de inmunoglobulina, o un conjugado de inmunoglobulina.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula CHO, una célula BHK, una célula HEK, una célula Sp2/0 o una célula PER.C6®.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha filtración de flujo tangencial utiliza una membrana con un valor de corte comprendido en el intervalo de entre 20 y 50 kDa de peso molecular.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha solución de inmunoglobulina presenta un valor de pH de entre 3, 0 y 10, 0.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho valor de pH se encuentra comprendido entre 3, 0 y 7, 0.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la presión transmembranal y el flujo transversal pueden modificarse a cualquier valor de concentración en los intervalos de concentración solapantes.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el intervalo de concentraciones en la etapa a) es de entre 5 y 25 mg/ml, en la etapa b) es de entre 25 y 50 mg/ml y en la etapa c) es de entre 50 y 140 mg/ml.