Estabilización de la termolisina en solución acuosa.

Un método para preparar una solución de termolisina (EC 3.4.24.

27) en la que la termolisina disuelta se presentaen forma estabilizada, y el método incluye el primer paso (P) de mezclar una preparación sólida que incluyetermolisina con un disolvente acuoso y elaborar una primera solución, en la que el preparado sólido incluyetermolisina a una concentración de aproximadamente el 20% [peso/peso] o mayor,

y en el que la primera solución incluye

(i) una sal tampón capaz de mantener un pH en el rango de entre 4,5 y 9,

(ii) una o más sales, y

(iii) termolisina,

y en la primera solución la concentración del preparado que incluye termolisina en el disolvente acuoso se encuentraen el rango de entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, y la concentración total de una omás sales, que incluyen la(s) sal(es) tampón, se encuentra en el rango de entre aproximadamente 0,1 mM y 500mM, y en el que el método también incluye el subsiguiente paso (Q) de añadir a la primera solución una cantidadmedida de una sal adicional, en el que la sal se selecciona a partir del grupo que incluye NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ,KCI, LiCl, MgCl2, CaCl2, y una mezcla de las mismas, y disolver la sal adicional, y en el que la concentración total dela sal adicional en la solución obtenida tras el paso (Q) se encuentra en el rango de entre aproximadamente 1,5 M yaproximadamente 5 M,

preparando así una segunda solución en la que la termolisina disuelta se presenta en forma estabilizada.

Estabilización de la termolisina en solución acuosa La presente invención pertenece al campo de la bioquímica. La presente invención trata sobre la enzima proteolítica termolisina, que tiende a ser inestable en solución acuosa. La invención proporciona métodos y compuestos para potenciar la estabilidad de la termolisina disuelta en solución acuosa. La termolisina, la termolisina en bruto o un liofilizado que contiene termolisina y una o más sales, se ponen en contacto con un tampón acuoso con una concentración salina baja y se forma una primera solución. Subsiguientemente, se añade una sal adicional en forma sólida y se disocia para formar así una segunda solución que incluye termolisina en una forma estabilizada.

Antecedentes de la invención La termolisina [EC 3.4.24.27; número de registro CAS 9073-78-3] es una metaloproteinasa neutra termoestable (también referida aquí como "proteasa neutra") producida en el caldo de cultivo de Bacillus termoproteolyticus (Endo, S., J., Ferment. Technol. 40 (1962) 346-353; Matsubara, H., Feder, J., in: 3ª edición, Boyer, P., D., (editiores) , The Enzymes, vol. 3, Academic Press, Nueva York, 1971, páginas 721-795) . Ésta requiere un ión de zinc para la actividad enzimática y cuatro iones de calcio para su estabilidad estructural (Latt, S., A., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 37 (1969) 333-339; Feder, J., et al. Biochemistr y 10 (1971) 4552-4556; Tajima, M., et al. Eur. J. Biochem. 64 (1976) 243-247) y cataliza especialmente la hidrólisis de puentes peptídicos que contienen residuos de aminoácido hidrófobos (Morihara, K., Tsuzuki, H., Eur. J. Biochem. 15 (1970) 374-380; Inouye, K., et al. Biochem. J. 315 (1996) 133-138) . La termolisina se utiliza ampliamente para la formación de puentes peptídicos mediante la reacción inversa a la hidrólisis (Oyama, K., et al., J. Chem.Soc. Perkin II (1981) 356-360; Nakanishi, K., et al, . Ann.

N.Y. Acad. Sci. 613 (1990) 652-655; Trusek-Holownia, A., J. Biotechnol. 102 (2003) 153-163) . El gen npr que codifica por la termolisina se aisló en B. termoproteolyticus (O’Donohue, M., J., et al., Biochem. J. 300 (1994) 599603) . El análisis de secuencias revela que la termolisina se sintetiza como una preproproteína que incluye un péptido señal (28 residuos) , una prosecuencia (204 residuos) , y una secuencia madura (316 residuos) (O’Donohue, M., J., et al., visto anteriormente) . La prosecuencia actúa como una chaperona intramolecular que conduce a la escisión autocatalítica del puente peptídico que une la prosecuencia y la secuencia madura (O’Donohue, M., J., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 26477-26481; Marie-Claire, C., et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 5697-5701; Marie-Claire, C., et al., J. Mol. Biol. 285 (1999) 1911-1915) .

Se puede calcular la extinción teórica a 280 nm de la termolisina intacta en agua mediante la utilización de la "herramienta ProtParam" que se encuentra disponible públicamente a través de internet (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html) . ProtParam es una herramienta que permite el cómputo de varios parámetros físicos y químicos para una proteína determinada almacenada en Swiss-Prot o TrEMBL o para una secuencia introducida por un usuario. Los parámetros computados incluyen el peso molecular, el pI teórico, la composición de aminoácidos, la composición atómica, el coeficiente de extinción, la semivida estimada, el índice de inestabilidad, el índice alifático y el promedio general de hidropaticidad. De acuerdo con esto, se puede calcular el valor de absorbancia teórico en agua de A (1 mg/ml) de 1, 696 a 280 nm.

El fabricante de la termolisina (Daiwa Kasei K.K., Japón) , haciendo referencia a Ohta, Y et al. (J. Biol. Chem. 241 (1966) 5919-5925) , indica una absorbancia de A (1 mg/ml) , de 1, 765 a 280 nm en 50 mM del tampón TrisHCl, pH de 7.

Inouye, K., et al. (J. Biochem. 123 (1998) 847-852) describe un valor de absorbancia A (1 mg/ml) de 1, 83, determinado a 277 nm y 25°C para el lote de termolisina T8BA51 (Daiwa Kasei K.K., Osaka, Japón) en 10 mM de CaCl2, 40 mM de TrisHCl, pH de 7, 5.

La termolisina puede obtenerse como un liofilizado a partir de proveedores comerciales. Daiwa Kasei K.K. (Japón) distribuye una termolisina con un peso molecular de 34.600 Da (Daltons) , un pH óptimo un pH 8, 0 y una temperatura óptima de entre 65°C y 70°C. De acuerdo con el fabricante, la enzima es estable en un intervalo de pH de entre 5, 0 y 8, 5. Se indica una solubilidad de 0, 02% en la solución de tampón diluido. Se puede obtener termolisina cristalizada dos veces en forma de polvo amorfo liofilizado, en el que la enzima proteica representa el 60% [peso/peso] o superior en relación a la materia seca. La materia seca además contiene acetato cálcico anhidro (aproximadamente el 20% [peso/peso]) y acetato sódico anhidro (aproximadamente el 10% [peso/peso]) . Para la cristalización posterior, el fabricante describe un método que incluye los pasos de suspender el liofilizado a una concentración de entre el 1% [peso/volumen] y el 5% [peso/volumen] en una solución acuosa de 0, 01 M de acetato cálcico. El material suspendido se disuelve mediante la adición gota a gota de 0, 2 N de hidróxido de sodio bajo agitación para que el pH de la solución acuosa presente un valor comprendido entre 11, 0 y 11, 4. Tras la sustracción de cualquier residuo no disuelto, el pH de la solución se ajusta a un pH de 6, 0 con 0, 2 N de ácido acético. Habitualmente, la cristalización se completa en aproximadamente 2 días. El proceso completo se lleva a cabo a una temperatura de entre 0° y 2°C.

También están disponibles unos preparados de termolisina de Daiwa Kasei K.K. (Japón) bajo el nombre comercial THERMOASE.

La patente EP 0 640 687 describe una solución acuosa de 7 mM de CaCl2 y 1, 75 M de NaCl en la que se disolvió THERMOASE para dar como resultado una concentración de aproximadamente 36 mg/ml. La pureza de la termolisina en el polvo seco THERMOASE fue de aproximadamente el 20%. Si se tiene en cuenta la pureza, la concentración de termolisina en la solución acuosa fue de aproximadamente 7 mg/ml.

Inouye, K., et al. (J. Biochem. 123 (1998) 847-852) describieron que la termolisina es una proteína escasamente soluble. Se sugirió que la mayor parte de la superficie de la proteína es hidrófoba y esto se respalda por el hecho que la termolisina puede purificarse eficientemente mediante la cromatografía de interacción hidrófoba (Inouye, K., et al., Protein Expression and Purification 46 (2006) 248-255) . Como consecuencia de su baja solubilidad, la enzima tiene una fuerte tendencia a precipitar unas horas después de que se preparen las soluciones.

Inouye, K. et al. (J Biochem., visto anteriormente) también demostraron que la solubilidad de la termolisina en un disolvente acuoso puede aumentar si se disuelven ciertas sales neutras en el disolvente cuando éste se pone en contacto con un preparado liofilizado de termolisina. Se observó que el efecto era dependiente de (1) la temperatura, 15 (2) la sal neutra particular presente en el disolvente, y (3) la concentración de la sal neutra respectiva. En el documento de Inouye, K. et al. (J Biochem. , visto anteriormente) , la figura 2 describe los resultados de una serie de experimentos en los que se mezcló una cantidad excesiva del polvo liofilizado de termolisina (preparado de termolisina liofilizado y cristalizado tres veces (Daiwa Kasei K.K., Osaka, Japón; Lote T8BA51) ; utilizado sin purificación adicional) con un "tampón estándar" (10 mM de CaCl2, 40 mM de TrisHCl, pH de 7, 5) , que además contenía una sal a una concentración predeterminada (en el rango que va de 0, 5 M a 5 M) . La concentración de la proteína disuelta se determinó mediante espectrofotometría utilizando un valor de absorbancia, A (1 mg/ml) , a 277 nm de 1, 83 y una masa molecular de 34, 6 kDa.

Las tablas 1-4 reproducen los valores numéricos aproximados que indican las concentraciones de la proteína disuelta tal y como se describen gráficamente en la figura 2 de Inouye, K. et al. (J Biochem., visto anteriormente) , a dos temperaturas diferentes (0°C y 37°C) . Las concentraciones de proteína tabuladas se expresan en mg/ml. En cada tabla, se indican las sales disueltas en el tampón estándar, así como sus concentraciones respectivas.

Tabla 1

Concentraciones de proteína soluble (en [mg/ml]) a 0°C en tampón estándar que contiene sal

Sal NaClKCl LiCl NaBrNaJ Concentración de la sal en el tampón estándar 0, 5 M 1, 0 M 1, 5 M 2, 0 M 2, 5 M

06, 4 08, 9 010, 3 012, 2 011, 6

04, 5 06, 3 07, 5 06, 5 05, 3

01, 9 03, 3 04, 5 05, 3 06, 6

04, 4 06, 6 015, 6 025, 3 038, 4

05, 5 07, 8 020, 3 029, 2 032, 5

Tabla 2

Concentraciones de proteína... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar una solución de termolisina (EC 3.4.24.27) en la que la termolisina disuelta se presenta en forma estabilizada, y el método incluye el primer paso (P) de mezclar una preparación sólida que incluye termolisina con un disolvente acuoso y elaborar una primera solución, en la que el preparado sólido incluye termolisina a una concentración de aproximadamente el 20% [peso/peso] o mayor, y en el que la primera solución incluye (i) una sal tampón capaz de mantener un pH en el rango de entre 4, 5 y 9, 10 (ii) una o más sales, y

(iii) termolisina,

y en la primera solución la concentración del preparado que incluye termolisina en el disolvente acuoso se encuentra en el rango de entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, y la concentración total de una o 15 más sales, que incluyen la (s) sal (es) tampón, se encuentra en el rango de entre aproximadamente 0, 1 mM y 500 mM, y en el que el método también incluye el subsiguiente paso (Q) de añadir a la primera solución una cantidad medida de una sal adicional, en el que la sal se selecciona a partir del grupo que incluye NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, KCI, LiCl, MgCl2, CaCl2, y una mezcla de las mismas, y disolver la sal adicional, y en el que la concentración total de la sal adicional en la solución obtenida tras el paso (Q) se encuentra en el rango de entre aproximadamente 1, 5 M y

aproximadamente 5 M, preparando así una segunda solución en la que la termolisina disuelta se presenta en forma estabilizada.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en el paso (P) el preparado sólido que incluye termolisina también incluye una o más sales.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que en el paso (P) el preparado sólido incluye termolisina a una concentración en el rango de entre aproximadamente el 20% [peso/peso] y 100% [peso/peso].

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que en el paso (P) la concentración del preparado que incluye termolisina en el disolvente acuoso se encuentra en el rango de entre aproximadamente 20 mg/ml y aproximadamente 60 mg/ml.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que en el subsiguiente paso (Q) la sal 35 adicional se añade en forma sólida.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la concentración de iones sulfato en la primera solución obtenida en el paso (P) se encuentra en el rango de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM.

7. El método de acuerdo con reivindicación 6, en el que la concentración total de la sal adicional en la segunda solución obtenida tras el paso (Q) se encuentra en el rango de entre aproximadamente 2 M y aproximadamente 3, 5

M.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que en la segunda solución obtenida tras el paso (Q) la concentración de termolisina es de aproximadamente 5 mg/ml o mayor, y menor de aproximadamente 35 mg/ml.

9. El método de acuerdo con reivindicación 8, en el que en la segunda solución obtenida tras el paso (Q) la 50 concentración de termolisina es de aproximadamente 10 mg/ml o mayor, y menor de aproximadamente 35 mg/ml, y la sal adicional en el paso (Q) se selecciona a partir del grupo que incluye NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, KCI, LiCl, MgCl2, CaCl2.