Epítopos funcionales del antígeno PsaA de Streptococcus pneumoniae y usos de los mismos.

Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos definida en la SEC ID Nº 1.

Epítopos funcionales del antígeno PsaA de Streptococcus pneumoniae y usos de los mismos.

Antecedentes [0001] Streptococcus pneumoniae es una causa principal de morbilidad y mortalidad global, provocando 1, 5 millones de muertes cada año en todo el mundo, por ejemplo, de neumonía, bacteremia, meningitis, y otitis media principalmente en niños de <5 años de edad.

Están disponibles vacunas satisfactorias de polisacárido en los Estados Unidos. Sin embargo, países con recursos limitados no pueden producir estas vacunas. Las vacunas actuales (polisacárido 23-valente (adultos) ; y polisacárido 7-valente (niños) ) protegen contra los serotipos más prevalentes. Existen 90 serotipos conocidos de Streptococcus pneumoniae. Sin embargo, existe la necesidad de una vacuna que proteja contra todos los serotipos conocidos. La adhesina A de superficie de neumococos (PsaA) es una proteína común de estreptococos, y es una vacuna candidata que podría producirse para todos los países.

Descripción resumida [0003] Se proporciona un péptido P4, que contiene un epítopo de la proteína PsaA de Streptococcus pneumoniae, y métodos y composiciones relacionados.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la adherencia media de 0, 9 mg/ml, 0, 53 mg/ml, 5, 3 μg/ml, y 0, 53 μg/ml de perlas recubiertas con rPsaA a células Detroit 562 (media de UF ± ET) cuando se añadían 1.640 ± 210 perlas por pocillo.

La Figura 2 muestra la adherencia del lote de 0, 53 mg/ml de perlas PsaA, perlas recubiertas con P4, y perlas de control recubiertas con glicina cuando se añadían 1640 ± 210 perlas por pocillo.

La Figura 3 muestra la adherencia de fluoroesferas recubiertas con rPsaA a células nasofaríngeas Detroit 562. Panel A. Fluoroesferas recubiertas con rPsaA (Molecular Probes, 1 μm de diámetro) adherentes después de 5

lavados por pocillo. Panel B. Inhibición de la adherencia de fluoesferas recubiertas con rPsaA mediante la adición de suero humano (suero 7074, dilución 1:10) que contenía anticuerpos anti-PsaA (18, 3 μg/ml, no diluido) . Aumento de campo 400x. Las imágenes se capturaron usando un microscopio fluorescente invertido Leitz y una cámara digital. El diámetro de la fluoesfera es de 1 μm.

La Figura 4 muestra la identificación de la secuencia de aminoácidos del péptido 4 (P4) mediante la comparación de las secuencias de los péptidos P1, P2, y P3 con la región PsaA en cuestión.

La Figura 5 muestra la adherencia media de fluoroesferas recubiertas con P1, P2, P3, P4, y rPsaA a células Detroit 562 (media de UF ± ET) cuando se añadían 3.100 ± 500 fluoroesferas por pocillo. Las fluoroesferas de 45 control se recubrieron con glicina para bloquear cualquier grupo carboxilo reactivo.

La Figura 6 muestra la adherencia a células nasofaríngeas Detroit 562 de fluoroesferas recubiertas con diversas concentraciones de rPsaA (900, 530, 5, 3 y 0, 53 μg/ml) . La señal de adherencia se da como la media de las UF ± ET cuando se añadían 1.640 ± 210 fluoroesferas por pocillo. La adherencia de las fluoesferas rPsaA recubiertas 50 con 1 mg/ml de rPsaA se muestra en la Fig. 2A.

La Figura 7 muestra la inhibición competitiva de la adherencia de fluoesferas recubiertas con rPsaA mediante la adición de péptido (10 μg/pocillo, 3 a 5 x 10-2 mM) P1, P2, P3, P4, o 3 μg/pocillo (9 x 10-4 mM) de proteína rPsaA. Concentraciones adicionales de rPsaA [intervalo = 0, 125 a 10, 0 μg/pocillo (0, 4 a 29, 7 x 10-4 mM) ] no produjeron 55 ninguna reducción adicional de la adherencia de las fluoesferas recubiertas con rPsaA. Aunque no se muestra, se observo una reducción del 95, 9% de la adherencia de las fluoesferas recubiertas con rPsaA cuando se usaban 20 μg/pocillo (6, 2 x 10-2 mM) de péptido homólogo P4 en la reacción de inhibición. La media (barras) y la SD (bigotes) representan el porcentaje promedio de la reducción obtenida en 3 ensayos diferentes usando múltiples concentraciones de fluoesferas PsaA (225 a 7.200 fluoesferas por pocillo) con señales que varían entre 60 5.500 y 100.000 UF para inhibiciones heterólogas del péptido y entre 5.500 y 23.000 UF para inhibición homólogas de PsaA.

La Figura 8 muestra el efecto de la adsorción parcial de anticuerpos contra PsaA en suero 7051 en la inhibición de la adherencia de fluoroesferas recubiertas con rPsaA. 65

Descripción detallada [0005] Como se usa en la memoria y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia a 5 "un vehículo farmacéutico" incluye mezclas de dos o más de dichos vehículos, y similares.

Péptidos/polipéptidos/proteínas [0006] Se proporciona un péptido P4, que contiene un epítopo de la proteína PsaA de Streptococcus pneumoniae. Se proporciona un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos definida en la SEC ID Nº 1 (LFVESSVKRRPMKTVSQDTNIPIYAQIF) , un ejemplo del péptido P4.

También se proporciona un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos definida como LFVDSSVDDRPMKTVSQDTNIPIYAQIF (SEC ID Nº 2) . Este péptido es un ejemplo más de un péptido P4, y difiere de la SEC ID Nº 1 en que el D en el resto 4 es E en P4, y los dos aminoácidos subrayados (DD en las posiciones 8 y 9) son "KR" en la secuencia P4. Se describe que un péptido P4 puede tener una, dos o las tres sustituciones de aminoácido mostradas en la SEC ID Nº 2.

La expresión "péptido" o "parte peptídica" se usa ampliamente en la presente memoria para indicar dos o más aminoácidos unidos por un enlace peptídico. La expresión "fragmento" o "fragmento proteolítico" se usa en la presente memoria para hacer referencia a un producto que puede producirse mediante una reacción proteolítica sobre un polipéptido, es decir, un péptido producido tras la escisión de un enlace peptídico en los polipéptidos. Aunque la expresión "fragmento proteolítico" se usa generalmente en la presente memoria para hacer referencia a un péptido que puede producirse mediante una reacción proteolítica, debe reconocerse que el fragmento no tiene que producirse necesariamente mediante una reacción proteolítica, sino que también puede producirse usando métodos de síntesis química o métodos de tecnología de ADN recombinante, para producir un péptido sintético que es equivalente a un fragmento proteolítico. Debe reconocerse que el término "péptido" no se usa en la presente memoria para sugerir un tamaño particular o cantidad de aminoácidos que comprende la molécula, y que un péptido de la invención puede contener hasta varios restos aminoacídicos o más.

Por "polipéptido aislado" o "polipéptido purificado" se entiende un polipéptido (o un fragmento del mismo) que está sustancialmente libre de los materiales con que el polipéptido está normalmente asociado en la naturaleza. Los polipéptidos de la invención, o fragmentos de los mismos pueden obtenerse, por ejemplo, mediante extracción de una fuente natural (por ejemplo, una célula bacteriana) , mediante expresión de un ácido nucleico recombinante que codifique el polipéptido (por ejemplo, en una célula o en un sistema de traducción sin células) , o mediante síntesis química del polipéptido. Además, los fragmentos polipeptídicos pueden obtenerse por cualquiera de estos métodos, o escindiendo la proteína PsaA de longitud completa seguido de la purificación del fragmento.

Un fragmento de una proteína o polipéptido de referencia incluye solamente aminoácidos contiguos de la proteína/polipéptido de referencia, y es al menos un aminoácido más corto que la secuencia de referencia.

También se proporcionan variantes de la SEC ID Nº 1. Por ejemplo, el péptido de la SEC ID Nº 2 es una variante del péptido de la SEC ID Nº 1. También se describen variantes de la SEC ID Nº 2.

El péptido puede comprender aminoácidos además de los expuestos en la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2. Por ejemplo, los aminoácidos adicionales pueden corresponder a uno o más aminoácidos N-terminales y/o Cterminales contiguos de PsaA. En un ejemplo el péptido consiste en la SEC ID Nº 1, más combinaciones de 0 a 6 aminoácidos en el extremo N-terminal y de 0 a 6 aminoácidos en el extremo C-terminal, en el cual los aminoácidos son aminoácidos contiguos que flanquean la SEC ID Nº 1 en una PsaA nativa (también mencionada como "no mutante" o "de origen natural") (por ejemplo, la PsaA descrita en GenBank, NCBI, base de datos Blast disponible en www.ncbi.nlm.nih.gov/blas/Blast.cqi, con el número de acceso gi|7920462|gb|AAF70667.1) . En la mayoría de los casos hay de 0 a 3 aminoácidos adicionales en cada extremo, en los cuales los... [Seguir leyendo]

1. Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos definida en la SEC ID Nº 1.

2. El péptido de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento y/o prevención de infecciones neumocócicas inhibiendo la unión de la proteína adhesina A de superficie neumocócica (PsaA) y/o Streptococcus pneumoniae a células que expresan un receptor de PsaA.

3. El péptido de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento y/o prevención de infecciones neumocócicas inhibiendo la unión de un Streptococcus pneumoniae transparente a una célula y/o potenciando la unión o internalización del fenotipo opaco.

4. El péptido de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento y/o prevención de infecciones neumocócicas

potenciando la internalización de Streptococcus pneumoniae por células de la nasofaringe. 15

5. El péptido de la reivindicación 1 para su uso en el aumento del desarrollo de células neurales y la curación de heridas aumentando la expresión de FGFbásico por una célula.

6. El péptido de la reivindicación 1 para su uso en la reversión o retardo de metástasis tumoral disminuyendo la expresión por parte de una célula de una o más citoquinas seleccionadas entre el grupo que consiste en IL-8, IL-16 y EGF.

7. Un método de cribado in vitro para identificar un anticuerpo que bloquea la unión de una proteína adhesina A de

superficie neumocócica (PsaA) a una célula, que comprende: 25

a. poner en contacto la célula con el péptido de la reivindicación 1 en presencia o ausencia del anticuerpo inhibidor putativo; y

b. determinar la cantidad de unión de péptido a la célula en presencia y ausencia del anticuerpo inhibidor putativo, mediante lo cual una cantidad reducida de unión del péptido en presencia del anticuerpo en comparación con la cantidad de unión en ausencia del anticuerpo identifica el anticuerpo como un anticuerpo que bloquea la unión de la proteína adhesina A de superficie neumocócica (PsaA) a células epiteliales.

8. El método de cribado in vitro de la reivindicación 7, en el cual la PsaA es una célula bacteriana.

9. El método de cribado in vitro de la reivindicación 7, en el cual la PsaA está purificada.

10. Un método de cribado in vitro para identificar un anticuerpo que bloquea la unión de Streptococcus pneumoniae a una célula, que comprende:

a. poner en contacto la célula con el péptido de la reivindicación 1 en presencia o ausencia del anticuerpo inhibidor putativo; y

b. determinar la cantidad de unión de péptido a la célula en presencia y ausencia del anticuerpo inhibidor putativo, mediante lo cual una cantidad reducida de unión del péptido en presencia del anticuerpo en comparación con la cantidad de unión en ausencia del anticuerpo identifica el anticuerpo como un anticuerpo que

bloquea la unión de Streptococcus pneumoniae a células epiteliales.

11. Una vacuna que comprende el péptido de la reivindicación 1 y un portador farmacéutico.

12. El péptido de la reivindicación 1 para su uso en la inhibición de la unión de la proteína adhesina A de superficie neumocócica (PsaA) a células que expresan un receptor de PsaA.

13. El uso del péptido de la reivindicación 1 para preparar un medicamento destinado al tratamiento y/o prevención de infecciones neumocócicas inhibiendo la unión de la proteína adhesina A de superficie neumocócica (PsaA) a células que expresan un receptor de PsaA.

14. El uso del péptido de la reivindicación 1 para preparar un medicamento destinado al tratamiento y/o prevención de infecciones neumocócicas inhibiendo la unión de un Streptococcus pneumoniae transparente a una célula y/o potenciando la unión o internalización del fenotipo opaco.

15. El uso del péptido de la reivindicación 1 para preparar un medicamento destinado al tratamiento y/o prevención de infecciones neumocócicas potenciando la internalización de Streptococcus pneumoniae en células de la nasofaringe.

16. El uso del péptido de la reivindicación 1 para preparar un medicamento para aumentar el desarrollo de células 65 neurales y la curación de heridas aumentando la expresión de FGFbásico por una célula.

17. El uso del péptido de la reivindicación 1 para preparar un medicamento para revertir o retardar la metástasis tumoral disminuyendo la expresión por parte de una célula de una o más citoquinas seleccionadas entre el grupo que consiste en IL-8, IL-16 y EGF.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citadas en la descripción 65 5