Elementos reguladores de ácidos nucleicos.

Ácido nucleico que contiene TE-13 (SEQ ID Nº 15) o un fragmento de TE-13 (SEQ ID Nº 15) o sussecuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de TE-13 (SEQ ID Nº 15) o sus secuencias denucleótidos complementarias,

en donde el ácido nucleico, el fragmento, el derivado o sus secuencias de nucleótidoscomplementarias conduce, en el caso de una integración cromosómica, a un aumento de la transcripción o bien dela expresión de un gen de interés en un sistema de expresión, y en donde el derivado presente una identidad de lasecuencia de al menos el 85%.

Elementos reguladores de ácidos nucleicos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

SECTOR TÉCNICO

La invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos cis-activas, los llamados elementos TE. Los elementos TE provienen preferentemente del genoma CHO. Su empleo en, por ejemplo, vectores de expresión permite en poblaciones celulares estables una expresión de un gen de interés por lo menos dos veces más elevada en comparación con los vectores utilizados hasta ahora en cualquier locus cromosómico.

ANTECEDENTES

Las células de mamíferos son las células huésped preferidas para la producción de proteínas biofarmacéuticas complejas, ya que las modificaciones realizadas después de la traducción son compatibles con humanos desde un punto de vista funcional como también farmacocinético. Los tipos celulares preferentemente relevantes son hibridomas, mielomas, células de CHO (Chinese Hamster Ovar y ) y células de BHK (Baby Hamster Kidney) . El cultivo de las células huésped se realiza de modo creciente en condiciones de producción libres de suero y de proteínas. Los motivos para ello son la reducción de costos asociada a ello, la menor interferencia en la purificación de la proteína recombinante, así como la reducción del potencial para la introducción de patógenos (por ejemplo, priones, virus) . La aplicación de células CHO como células huésped tiene cada vez más difusión, ya que estas células se pueden adaptar al crecimiento en suspensión en un medio libre de suero y de proteína y, al mismo tiempo, son consideradas y aceptadas como células productivas seguras según las autoridades de regulación.

Para generar una línea celular de mamífero estable que expresa un gen heterólogo de interés, se incorpora el gen heterólogo por lo general junto con un gen marcador seleccionable tal como, por ejemplo, neomicinafosfotransferasa (NPT) , por transfección en la línea celular deseada. El gen heterólogo y el gen marcador seleccionable se pueden expresar en una célula huésped, a partir de un único vector o de vectores cotransfectados, separados. Dos a tres días después de la transfección, las células transfectadas se convierten en medio que contiene un agente selectivo, por ejemplo, G418 al usar el gen de neomicina-fosfotransferasa (gen NPT) , y se cultivan durante algunas semanas en estas condiciones selectivas. Las células resistentes de alto crecimiento que tienen integrado el ADN exógeno se pueden aislar e investigar en cuanto a la expresión del producto génico deseado (gen de interés) .

Para la producción biofarmacéutica son necesarias líneas celulares con productividad alta y estable. Los vectores de expresión para las células de producción son provistos de promotores y potenciadores (“enhancer”) fuertes, que expresan principalmente en forma constitutiva tales como, por ejemplo, el potenciador y el promotor de CMV, para posibilitar una alta expresión del producto. Como esta expresión del producto tiene que ser garantizada durante un período de tiempo en lo posible prolongado, se seleccionan células que han integrado el gen del producto en forma estable en su genoma. Esto se realiza con marcadores de selección tales como, por ej., la neomicinafosfotransferasa (NPT) y la dihidrofolato-reductasa (DHFR) .

Por la integración casual de los vectores de expresión en el genoma de la célula huésped se obtienen células con una expresión de distinta magnitud del producto de gen deseado, ya que su expresión no está condicionada solamente por la intensidad del promotor precedente o de la combinación promotor/potenciador. La estructura de cromatina que se encuentra en el lugar de integración puede influir sobre la magnitud de la expresión tanto en forma negativa como también positiva. En forma creciente se integran en los vectores de expresión por lo tanto también elementos cis-activos, los cuales influyen de manera positiva sobre la expresión a nivel de la cromatina. Estos comprenden las regiones de control de locus (“Locus Control Regions”) (LCR) , las que se encuentran, por ej., en la región 5’ del gen de la ß-globina (Li y col., 2002) y en la región 3’ del gen TCRα. Estas provocan una alta expresión específica del tejido de un transgén acoplado en la cromatina, la cual se caracteriza por la independencia de la posición y la dependencia del número de copias. Estas propiedades indican que las LCRs son capaces de abrir la cromatina en su tejido nativo (Ortiz et al., 1997) . Existen diversas formas de ß-talasemia en las cuales el locus de la ß-globina se encuentra intacto, pero no se expresa. El motivo de la falta de expresión es una gran deleción en dirección 5’ del gen de la ß-globina. La deleción de esta LCR de ß-globina conduce a una conformación de cromatina cerrada, la cual se extiende a través de todo el locus y lleva a una supresión de la expresión del gen (Li et al., 2002) . Las LCRs se colocalizan con sitios hipersensibles (HS) a la ADNasa I en las células que expresan cromatina. La presencia de HA indica igualmente una cromatina abierta. Los HS contienen una serie de diferentes sitios de ligadura generales y específicos del tejido para los factores de transcripción. Mediante la interacción de los factores de transcripción con el ADN se forma la estructura abierta de la cromatina de los HS (Li et al., 2002) . De algunas LCRs se conoce que están compuestas por varios HS, cuyas funciones pueden ser delimitadas más o menos una de otra. El gen de TCRα, por ejemplo, es expresado bajo el control endógeno sólo en el tejido de las células T. El locus existe, según el tejido y el estado de expresión, en diversos modos de cromatina. Posee en la zona 3’ una región de control de locus, que presenta ocho HS. El HS 2 – 6, un fragmento parcial de 6 kb de la LCR

actúa abriendo la cromatina y no es específico del tejido. La especificidad con respecto al tejido le es otorgada a la expresión específica de las células T en el timo por el HS 7, 8 y 1 (3 kb) . Sólo en la combinación completa de todos los HS se encuentra funcionalmente completa la TCRαLCR (Ortiz et al., 1997) . Una subdivisión y especificación más exacta de las funciones HS individuales de la TCRαLCR se puede leer en (Ortiz et al., 1999) . Este ejemplo muestra que las LCRs son funcionalmente muy complejas y que pueden estar compuestas por diversos elementos de control como potenciadores, silenciadores y aisladores. Otros ejemplos para una división de las funciones de las LCR en diversos dominios son el locus de TCRγ y el locus de ß-globina. El primero está compuesto por el sitio hipersensible a la ADNsa I HsA y el potenciador 3’ECγ1. A la TCRγ-LCR se le adjudican además de las tareas usuales, un rol en la recombinación del gen TCRγ (Baker et al., 1999) . El locus de ß-globina presenta cinco HS con diversas funciones, las que para su funcionamiento completo necesitan además el promotor específico del tejido. Las LCRs podrían jugar otro rol importante en la desmetilación del ADN específica del tejido, ya que la mutilación de ADN provoca una estructura de cromatina cerrada y la inactivación de genes. También sería posible un mecanismo de acción que activa la expresión del gen por medio de una acetilación aumentada de histona (Li et al., 2002) .

Las regiones de andamio/unión a la matriz (“Scaffold/Matrix Attachment Regions”) (S/MARs) son secuencias de ADN que se ligan con alta afinidad in vitro a componentes de la matriz o de la estructura del núcleo celular. Ellas forman los límites estructurales y posiblemente también funcionales de los dominios de cromatina (Zahn-Zabal et al., 2001) . Las S/MARs son capaces de interactuar con los potenciadores así como también de aumentar la accesibilidad del ADN en la cromatina localmente y de este modo pueden aumentar la expresión de genes heterólogos, integrados en forma estable, en líneas celulares, plantas y animales transgénicos (Klehr et al., 1991; Stief et al., 1989; Jenuwein et al., 1997; Zahn-Zabal et al., 2001) . Pero no pueden proteger a un locus cromosómico completamente de sus elementos circundantes para posibilitar una expresión independiente de la posición (Poljak et al., 1994) . El efecto de las MARs se puede usar para aumentar la parte de clones celulares que expresan (fuertemente) y/o animales transgénicos en un experimento de transfección (McKnight et al., 1992; Zahn-Zabal et al., 2001) . Sin embargo, también se informó de MARs que no producen una fuerte expresión, pero que tienen un rol importante en la regulación correcta de genes específicos para el desarrollo (McKnight et al., 1992) .

Los aisladores se definen como límite neutro entre regiones vecinas que se influyen mutuamente,... [Seguir leyendo]

1. Ácido nucleico que contiene TE-13 (SEQ ID Nº 15) o un fragmento de TE-13 (SEQ ID Nº 15) o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de TE-13 (SEQ ID Nº 15) o sus secuencias de nucleótidos complementarias, en donde el ácido nucleico, el fragmento, el derivado o sus secuencias de nucleótidos complementarias conduce, en el caso de una integración cromosómica, a un aumento de la transcripción o bien de la expresión de un gen de interés en un sistema de expresión, y en donde el derivado presente una identidad de la secuencia de al menos el 85%.

2. Ácido nucleico que contiene TE-08 (SEQ ID Nº 10) o un fragmento de TE-08 (SEQ ID Nº 10) o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de TE-08 (SEQ ID Nº 10) o sus secuencias de nucleótidos complementarias, en donde el ácido nucleico, el fragmento, el derivado o sus secuencias de nucleótidos complementarias conduce, en el caso de una integración cromosómica, a un aumento de la transcripción o bien de la expresión de un gen de interés en un sistema de expresión, y en donde el derivado presente una identidad de la secuencia de al menos el 85%.

3. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho ácido nucleico contiene la SEQ ID Nº 1 o un fragmento de SEQ ID Nº 1 que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de SEQ ID Nº 1 o sus secuencias de nucleótidos complementarias, en donde el ácido nucleico, el fragmento, el derivado o sus secuencias de nucleótidos complementarias conduce, en el caso de una integración cromosómica, a un aumento de la transcripción o bien de la expresión de un gen de interés en un sistema de expresión, en donde el fragmento o derivado comprende por lo menos una zona de secuencias de la zona de ácidos nucleicos entre 1 pb y 1578 pb y en donde el derivado presente una identidad de la secuencia de al menos el 85%.

4. Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el aumento de la transcripción o bien de la expresión de un gen de interés en un sistema de expresión en comparación con un control que no contiene ningún elemento TE se determina por medición de la titulación del producto.

5. Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque este ácido nucleico presenta una longitud de al menos 511 pb (= longitud TE-13, SEQ ID Nº 15) o bien al menos 1015 pb (= longitud TE08, SEQ ID Nº 10) .

6. Ácido nucleico, seleccionado del grupo compuesto por: TE-01 (SEQ ID Nº 3) , TE-02 (SEQ ID Nº 4) , TE-07 (SEQ ID Nº 9) , TE-08 (SEQ ID Nº 10) , TE-10 (SEQ ID Nº 12) , TE-11 (SEQ ID Nº 13) , TE-12 (SEQ ID Nº 14) , TE-13 (SEQ ID Nº 15) , TE-15 (SEQ ID Nº 17) , TE-17 (SEQ ID Nº 19) , TE-18 (SEQ ID Nº 20) .

7. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el ácido nucleico es TE-08 (SEQ ID Nº 10) .

8. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el ácido nucleico es TE-13 (SEQ ID Nº 15) .

9. Vector de expresión eucarionte, caracterizado porque este vector de expresión contiene un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Vector de expresión eucarionte de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque contiene una combinación de varios ácidos nucleicos iguales o diferentes de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde uno o varios ácidos nucleicos están posicionados delante (es decir, 5’ de) y / o uno o varios ácidos nucleicos detrás (es decir, 3’ de) del gen de interés.

11. Vector de expresión eucarionte de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque uno o varios ácidos nucleicos de TE-08 (SEQ ID Nº 10) están posicionados delante (es decir, 5’ de) y uno o varios están posicionados detrás (es decir, 3’ de) del gen de interés, con preferencia un ácido nucleico de TE-08 delante y uno detrás.

12. Procedimiento para la preparación de un vector de expresión eucarionte, caracterizado por la integración de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 en un vector de expresión.

13. Célula huésped eucarionte, caracterizada porque contiene un vector de expresión eucarionte de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 11.

14. Célula huésped eucarionte de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada porque hay alta producción de ella, es decir, posee una mayor productividad específica que una célula huésped eucarionte comparable sin elemento TE, en donde esta célula huésped tiene un nivel de expresión aumentado en hasta dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces o diez veces o un nivel de expresión aumentado en más de dos

veces, más de tres veces, más de cuatro veces, más de cinco veces, más de siete veces o más de diez veces.

15. Procedimiento para desarrollar una línea celular huésped eucarionte establemente transfectada de alta producción, caracterizado por las siguientes etapas:

(a) integración de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 en un vector de expresión eucarionte que contiene un gen de interés,

(b) transfección de una célula huésped eucarionte con este vector de expresión,

(c) selección de una célula huésped transfectada de alta producción.

16. Procedimiento para la preparación y selección de células de mamíferos recombinantes, caracterizado por las siguientes etapas:

(a) transfección de las células huésped con genes que por lo menos codifican una proteína/producto de interés, una neomicina-fosfotransferasa, preferentemente modificada, y el marcador de selección amplificable DHFR, en donde por lo menos el gen (o bien los genes) de interés está unido funcionalmente para el incremento de la transcripción o bien de la expresión con por lo menos un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8,

(b) cultivo de las células en condiciones que permiten una expresión de los distintos genes,

(c) la selección de estos genes co-integrados por cultivo de las células en presencia de un medio de selección como, por ejemplo, G418, en medio sin hipoxantina/timidina y

(d) la amplificación de estos genes co-integrados por cultivo de las células en presencia de un medio de selección, que permite la amplificación de por lo menos el gen marcador de selección como, por ejemplo, metotrexato.

17. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 15 ó 16, en donde la proporción de grandes productores está aumentado en hasta dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces o diez veces o más de dos veces, más de tres veces, más de cuatro veces, más de cinco veces, más de siete veces, más de diez veces.

18. Procedimiento para preparar un producto biofarmacéutico, caracterizado por las siguientes etapas:

(a) integración de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 en un vector de expresión eucarionte que contiene un gen de interés,

(b) transfección de una célula huésped eucarionte con este vector de expresión,

(c) selección de una célula huésped transfectada de alta producción y

(d) cultivo de la célula huésped transfectada obtenida de alta producción en condiciones que permiten una expresión del o de los genes de interés.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18 caracterizado por la siguiente etapa adicional:

(e) siembra y purificación de la proteína de interés.

20. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparación de un medicamento para uso medicinal, en donde el ácido nucleico sirve como elemento que aumenta la transcripción para preparar un producto biofarmacéutico.

21. Uso de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el producto biofarmacéutico es un anticuerpo monoclonal.

22. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 para la generación de animales

o plantas transgénicos no humanos.

23. Kit compuesto de ácido o ácidos nucleicos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, y célula o células huésped y opcionalmente reactivo o reactivos de transfección.