Dominios de receptores gustativos T1R3 y genes que los codifican.

Una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica la región extracelular o transmembrana de un polipéptidodel receptor gustativo T1R3 que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%,

al menos el 95%, al menos el96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% con el polipéptido T1R3 en la SEC ID Nº: 4 o 14.

Dominios de receptores gustativos T1R3 y genes que los codifican Antecedentes de la Invención

Campo de la Invención La invención se refiere a receptores quimiosensoriales de mamíferos recientemente identificados acoplados a proteína G, a la familia de dichos receptores y a los genes y ADNc que codifica dichos receptores. Más particularmente, la invención se refiere a receptores quimiosensoriales de mamíferos recientemente identificados acoplados a proteína G activos en la señalización del gusto, a una familia de dichos receptores, a los genes y ADNc que codifica dichos receptores y a métodos de uso de dichos receptores, genes y ADNc en el análisis y descubrimiento de moduladores gustativos.

Descripción de la Técnica Relacionada El sistema gustativo proporciona información sensorial acerca de la composición química del mundo exterior. La transducción gustativa es una de las formas más sofisticadas de sensación activada por productos químicos en los animales. Hasta ahora, los medios mediante los cuales se producen las sensaciones gustativas continúan sin entenderse bien. Véase, por ejemplo, Margolskee, BioEssays, 15: 645-50 (1993) ; Avenet et al., J. Membrane Biol., 112:1-8 (1989) . La señalización gustativa se encuentra en todo el reino animal, desde los simples metazoos a los vertebrados más complejos. Se cree que en la sensación gustativa participan distintas rutas de señalización. Se cree que los receptores median estas rutas, es decir, receptores metabotrópicos o ionotrópicos. Las células que expresan receptores gustativos, cuando se exponen a determinados estímulos químicos, producen la sensación gustativa mediante despolarización para generar un potencial de acción, que se piensa que desencadena la sensación. Se piensa que este hecho desencadena la liberación de neurotransmisores en la sinapsis neuronal aferente gustativa, iniciando de esta manera la señalización a través de las rutas neuronales que median la percepción gustativa. Véase, por ejemplo, Roper, Ann. Rev. Neurosci., 12: 329-53 (1989) .

Así pues, los receptores gustativos reconocen específicamente moléculas que provocan la sensación específica gustativa. Estas moléculas también se denominan en este documento “sustancias gustativas”. Muchos receptores gustativos pertenecen a la superfamilia de receptores de 7 dominios transmembrana (Hoon et al., Cell 96: 541 (1999) ; Adler et al., Cell 100: 693 (2000) ) , también conocidos como receptores acoplados a proteína G (GPCR) . Se piensa que las proteínas de canal median otros gustos. Los receptores acoplados a proteína G controlan muchas funciones fisiológicas, tales como la función endocrina, la función exocrina, la frecuencia cardiaca, la lipólisis, el metabolismo de hidratos de carbono y la señalización transmembrana. El análisis bioquímico y la clonación molecular de varios de dichos receptores han revelado muchos principios básicos con respecto a la función de estos receptores.

Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.691.188 describe cómo tras la unión del GPCR a un ligando, presumiblemente el receptor experimenta un cambio conformacional lo que conduce a la activación de la proteína G. Las proteínas G están formadas por tres subunidades: una subunidad a unida a un nucleótido guanilo, una subunidad 1 y una subunidad y. Las proteínas G alternan entre dos formas, dependiendo de si en la subunidad a está unido GDP o GTP. Cuando está unido el GDP, la proteína G existe como un heterotrímero: el complejo Ga1y. Cuando está unido el GTP, la subunidad a se disocia del heterotrímero, dando un complejo G1y. Cuando un complejo Ga1y se asocia operativamente con un receptor activado acoplado a proteína G en una membrana celular, la velocidad de intercambio del GTP para unirse al GDP aumenta y la velocidad de disociación del enlace de la subunidad Ga del complejo Ga1y aumenta. La subunidad Ga libre y el complejo G1y son por tanto capaces de transmitir una señal a elementos aguas abajo de una diversidad de rutas de transducción de señal. Estos acontecimientos constituyen la base de una multiplicidad de fenómenos de diferente señalización celular, que incluyen por ejemplo, el fenómeno de señalización que se identifica como percepciones sensoriales neurológicas tales como el gusto y/o el olfato.

Se piensa que los mamíferos tienen cinco modalidades gustativas básicas: dulce, amargo, ácido, salado y umami (el sabor del glutamato monosódico) . Véase, por ejemplo, Kawamura et al., Introduction to Umami: A Basic Taste (1987) ; Kinnamon et al., Ann. Rev. Physiol., 54: 715-31 (1992) ; Lindemann, Physiol. Rev., 76: 718-66 (1996) ; Stewart et al., Am. J. Physiol., 272: 1-26 (1997) . Numerosos estudios fisiológicos en animales han demostrado que las células receptoras gustativas pueden responder de manera selectiva a diferentes estímulos químicos. Véase, por ejemplo, Akabas et al., Science, 242: 1047-50 (1988) ; Gilbertson et al., J. Gen. Physiol., 100: 803-24 (1992) ; Bernhardt et al., J. Physiol., 490: 325-36 (1996) ; Cummings et al., J. Neurophysiol., 75: 1256-63 (1996) .

En mamíferos, las células receptoras gustativas se agrupan en botones gustativos que están distribuidos en diferentes papilas en el epitelio de la lengua. Las papilas circunvaladas, localizadas en la parte más posterior de la lengua, contienen de cientos a miles de botones gustativos. A diferencia, las papilas foliadas, localizadas en el borde lateral posterior de la lengua, contienen de decenas a cientos de botones gustativos. Adicionalmente, las papilas fungiformes, localizadas en la parte delantera de la lengua, contienen únicamente un solo o algunos botones gustativos.

Cada botón gustativo, dependiendo de la especie, contiene de 50-150 células, incluyendo células precursoras, células de soporte y células receptoras gustativas. Véase, por ejemplo, Lindemann, Pysiol. Rev., 76: 718-66 (1996) . Las células receptoras se enervan en su base por terminaciones nerviosas aferentes que transmiten información a los centros gustativos del córtex a través de la sinapsis en el tronco cerebral y el tálamo. Para comprender la función, regulación y percepción del sentido del gusto, es importante aclarar los mecanismos de señalización de las células gustativas y el procesamiento de la información.

Aunque se sabe mucho sobre la psicofísica y la fisiología de la función de las células gustativas, se sabe muy poco sobre las moléculas y las rutas que median su respuesta de señalización sensorial. La identificación y el aislamiento de nuevos receptores gustativos y de moléculas señalizadoras gustativas podrían permitir nuevos métodos de modulación química y genética de las rutas de transducción gustativa. Por ejemplo, la disponibilidad de moléculas receptoras y de canal podría permitir la identificación de agonistas, antagonistas, agonistas inversos y moduladores de actividad gustativa de elevada afinidad. Dichos componentes de modulación gustativa podrían ser útiles en la industria farmacéutica y alimentaria para mejorar el gusto de una diversidad de productos de consumo o para bloquear gustos indeseables, por ejemplo, en determinados compuestos farmacéuticos.

Actualmente se conocen las secuencias completas o parciales de numerosos receptores quimiosensoriales en seres humanos y otros eucariotas. Véase, por ejemplo, Pilpel, Y. y Lancet, D., Protein Science, 8: 969-977 (1999) ; Mombaerts, P., Annu, Rev. Neurosci., 22: 487.50 (1999) . Véanse también, los documentos EPO867508A2, US 5874243, WO 92/17585, WO 95/18140, WO 97/17444, WO 99/67282. Debido a la complejidad de las interacciones receptor-ligando, y más particularmente de las interacciones receptor-sustancia gustativa, existe una carencia de información sobre el reconocimiento ligando-receptor. En parte, la presente invención aborda la necesidad de entender mejor las interacciones entre los receptores quimiosensoriales y los estímulos químicos. La presente invención también proporciona, entre otras cosas, nuevos receptores quimiosensoriales y métodos para utilizar dichos receptores, y los genes y los ADNc que codifican dichos receptores, para identificar moléculas que puedan usarse para modular la transducción quimiosensorial, tal como la sensación gustativa.

Sumario de la Invención La invención se refiere a una nueva familia de receptores acoplados a proteína G, y a los genes y a los ADNc que codifican dichos receptores. Se piensa que los receptores intervienen principalmente en la transducción del gusto dulce, pero también pueden intervenir en las señales de transducción de otras modalidades gustativas.

La presente invención proporciona una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica la región extracelular o trasmembrana de un polipéptido... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica la región extracelular o transmembrana de un polipéptido del receptor gustativo T1R3 que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% con el polipéptido T1R3 en la SEC ID Nº: 4 o 14.

2. La secuencia aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 que adicionalmente codifica la región transmembrana de otro polipéptido GPCR.

3. La secuencia aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 que adicionalmente codifica la región extracelular de otro polipéptido GPCR.

4. La secuencia aislada de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que está unida operativamente a un promotor regulable o a un promotor constitutivo.

5. Un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en vectores de mamíferos, vectores de insectos, vectores bacterianos, vectores de levaduras, vectores retrovirales, vectores bacteriófagos, plásmidos lineales o circulares, moléculas de ácido nucleico que son capaces de integrarse en el genoma de una célula deseada.

6. Una célula hospedadora que se ha transformado o transfectado ex vivo con una secuencia aislada de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4 o un vector de acuerdo con la reivindicación 5, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en células procariotas, células de mamífero, células de levadura, células de insecto, células de anfibio, células vegetales y células fúngicas.

7. La célula hospedadora de la reivindicación 6 que es una célula humana.

8. La célula hospedadora de la reivindicación 6 que se selecciona del grupo que consiste en E. coli, células CHO, células HeLa y células HEK-293.

9. La célula hospedadora de la reivindicación 6 que es una célula cultivada o un explante.

10. Un polipéptido T1R3 aislado, codificado por la secuencia aislada de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3.

11. Un ensayo in vitro para identificar un compuesto que modula la transducción gustativa que comprende:

(i) poner en contacto un polipéptido T1R3 de acuerdo con la reivindicación 10 con un supuesto compuesto modulador gustativo; y

(ii) detectar si dicho compuesto se une específicamente a dicho polipéptido T1R3.

12. El ensayo de la reivindicación 11 en el que dicho polipéptido T1R3 se expresa en una célula o en una membrana celular.

13. El ensayo de la reivindicación 11 en el que dicho polipéptido T1R3 está comprendido en un soporte de fase sólida.

14. El ensayo de la reivindicación 11 en el que dicho polipéptido T1R3 está en una solución.

15. El ensayo de la reivindicación 11 en el que dicho polipéptido T1R3 está unido a un polipéptido verde fluorescente.

FIG. 1