Una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido del receptor gustativo T1R1 que tiene al menos una identidad de secuencia del 90%,

al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con el polipéptido contenido en la SEC ID Nº: 17

Receptores gustativos T1R1 y genes que codifican los mismos.

Antecedentes de la invención

La invención se refiere a receptores quimiosensoriales de mamíferos recientemente identificados acoplados a proteínas G, a la familia de dichos receptores y a los genes y ADNc que codifica dichos receptores. Más particularmente, la invención se refiere a receptores quimiosensoriales de mamíferos recientemente identificados acoplados a proteínas G activos en la señalización del gusto, a una familia de dichos receptores, a los genes y ADNc que codifica dichos receptores y a métodos de uso de dichos receptores, genes y ADNc en el análisis y descubrimiento de moduladores gustativos.

El sistema gustativo proporciona información sensorial acerca de la composición química del mundo exterior. La transducción gustativa es una de las formas más sofisticadas de sensación activada por productos químicos en los animales. Hasta ahora, los medios mediante los cuales se producen las sensaciones gustativas continúan sin entenderse bien. Véase, por ejemplo, Margolskee, BioEssays, 15: 645-50 (1993); Avenet et al., J. Membrane Biol., 112:1-8 (1989). La señalización gustativa se encuentra en todo el reino animal, desde los simples metazoos a los vertebrados más complejos. Se cree que en la sensación gustativa participan distintas rutas de señalización. Se cree que los receptores median estas rutas, es decir, receptores metabotrópicos o ionotrópicos. Las células que expresan receptores gustativos, cuando se exponen a determinados estímulos químicos, producen la sensación gustativa mediante despolarización para generar un potencial de acción, que se piensa que desencadena la sensación. Se piensa que este hecho desencadena la liberación de neurotransmisores en la sinapsis neuronal aferente gustativa, iniciando de esta manera la señalización a través de las rutas neuronales que median la percepción gustativa. Véase, por ejemplo, Roper, Ann. Rev. Neurosci., 12: 329-53 (1989).

Así pues, los receptores gustativos reconocen específicamente moléculas que provocan la sensación específica gustativa. Estas moléculas también se denominan en este documento "sustancias gustativas". Muchos receptores gustativos pertenecen a la superfamilia de receptores de 7 dominios transmembrana (Hoon et al., Cell 96: 451 (1999); Adler et al., Cell 100: 693 (2000)), también conocidos como receptores acoplados a proteína G (GPCR). Se piensa que las proteínas de canal median otros gustos. Los receptores acoplados a proteína G controlan muchas funciones fisiológicas, tales como la función endocrina, la función exocrina, la frecuencia cardiaca, la lipólisis, el metabolismo de hidratos de carbono y la señalización transmembrana. El análisis bioquímico y la clonación molecular de varios de dichos receptores han revelado muchos principios básicos con respecto a la función de estos receptores.

Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.691.188 describe cómo tras la unión del GPCR a un ligando, presumiblemente el receptor experimenta un cambio conformacional lo que conduce a la activación de la proteína G. Las proteínas G están formadas por tres subunidades: una subunidad a unida a un nucleótido guanilo, una subunidad ß y una subunidad ?. Las proteínas G alternan entre dos formas, dependiendo de si en la subunidad a está unido GDP o GTP. Cuando está unido el GDP, la proteína G existe como un heterotrímero: el complejo Gaß?. Cuando está unido el GTP, la subunidad a se disocia del heterotrímero, dando un complejo Gß?. Cuando un complejo Gaß? se asocia operativamente con un receptor activado acoplado a proteína G en una membrana celular, la velocidad de intercambio del GTP para unirse al GDP aumenta y la velocidad de disociación del enlace de la subunidad Ga del complejo Gaß? aumenta. La subunidad Ga libre y el complejo Gß? son por tanto capaces de transmitir una señal a elementos aguas abajo de una diversidad de rutas de transducción de señal. Estos acontecimientos constituyen la base de una multiplicidad de fenómenos de diferente señalización celular, que incluyen por ejemplo, el fenómeno de señalización que se identifica como percepciones sensoriales neurológicas tales como el gusto y/o el olfato.

Se piensa que los mamíferos tienen cinco modalidades gustativas básicas: dulce, amargo, ácido, salado y umami (el sabor del glutamato monosódico). Véase, por ejemplo, Kawamura et al., Introduction to Umami: A Basic Taste (1987); Kinnamon et al., Ann. Rev. Physiol., 54: 715-31 (1992); Lindemann, Physiol. Rev., 76: 718-66 (1996); Stewart et al., Am. J. Physiol., 272: 1-26 (1997). Numerosos estudios fisiológicos en animales han demostrado que las células receptoras gustativas pueden responder de manera selectiva a diferentes estímulos químicos. Véase, por ejemplo, Akabas et al., Science, 242: 1047-50 (1988); Gilbertson et al., J. Gen. Physiol., 100: 803-24 (1992); Bernhardt et al., J. Physiol., 490: 325-36 (1996); Cummings et al., J. Neurophysiol., 75: 1256-63 (1996).

En mamíferos, las células receptoras gustativas se agrupan en botones gustativos que están distribuidos en diferentes papilas en el epitelio de la lengua. Las papilas circunvaladas, localizadas en la parte más posterior de la lengua, contienen de cientos a miles de botones gustativos. A diferencia, las papilas foliadas, localizadas en el borde lateral posterior de la lengua, contienen de decenas a cientos de botones gustativos. Adicionalmente, las papilas fungiformes, localizadas en la parte delantera de la lengua, contienen únicamente un solo o algunos botones gustativos.

Cada botón gustativo, dependiendo de la especie, contiene de 50-150 células, incluyendo células precursoras, células de soporte y células receptoras gustativas. Véase, por ejemplo, Lindemann, Pysiol. Rev., 76: 718-66 (1996). Las células receptoras se enervan en su base por terminaciones nerviosas aferentes que transmiten información a los centros gustativos del córtex a través de la sinapsis en el tronco cerebral y el tálamo. Para comprender la función, regulación y percepción del sentido del gusto, es importante aclarar los mecanismos de señalización de las células gustativas y el procesamiento de la información.

Aunque se sabe mucho sobre la psicofísica y la fisiología de la función de las células gustativas, se sabe muy poco sobre las moléculas y las rutas que median su respuesta de señalización sensorial. La identificación y el aislamiento de nuevos receptores gustativos y de moléculas señalizadoras gustativas podrían permitir nuevos métodos de modulación química y genética de las rutas de transducción gustativa. Por ejemplo, la disponibilidad de moléculas receptoras y de canal podría permitir la identificación de agonistas, antagonistas, agonistas inversos y moduladores de actividad gustativa de elevada afinidad. Dichos componentes de modulación gustativa podrían ser útiles en la industria farmacéutica y alimentaria para mejorar el gusto de una diversidad de productos de consumo o para bloquear gustos indeseables, por ejemplo, en determinados compuestos farmacéuticos.

Actualmente se conocen las secuencias completas o parciales de numerosos receptores quimiosensoriales en seres humanos y otros eucariotas. Véase, por ejemplo, Pilpel, Y. y Lancet, D., Protein Science, 8: 969-977 (1999); Mombaerts, P., Annu, Rev. Neurosci., 22: 487.50 (1999). Véanse también, los documentos EPO867508A2, US 5874243, WO 92/17585, WO 95/18140, WO 97/17444, WO 99/67282. Debido a la complejidad de las interacciones receptor-ligando, y más particularmente de las interacciones receptor-sustancia gustativa, existe una carencia de información sobre el reconocimiento ligando-receptor. En parte, la presente invención aborda la necesidad de entender mejor las interacciones entre los receptores quimiosensoriales y los estímulos químicos. La presente invención también proporciona, entre otras cosas, nuevos receptores quimiosensoriales y métodos para utilizar dichos receptores, y los genes y los ADNc que codifican dichos receptores, para identificar moléculas que puedan usarse para modular la transducción quimiosensorial, tal como la sensación gustativa.

Sumario de la invención

La invención se refiere a una nueva familia de receptores acoplados a proteína G, y a los genes y a los ADNc que codifican dichos receptores. Se piensa que los receptores intervienen...

1. Una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido del receptor gustativo T1R1 que tiene al menos una identidad de secuencia del 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con el polipéptido contenido en la SEC ID Nº: 17.

2. La secuencia aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 que codifica el polipéptido contenido en la SEC ID Nº: 17.

3. La secuencia aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de ácido nucleico contenida en la SEC ID Nº: 15 ó 16.

4. La secuencia aislada de ácido nucleico de T1R1 aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que está unida operativamente a un promotor regulable o a un promotor constitutivo.

5. Un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en vectores de mamíferos, vectores de insectos, vectores bacterianos, vectores de levaduras, vectores retrovirales, vectores bacteriófagos, plásmidos lineales circulares, moléculas de ácido nucleico que son capaces de integrarse en el genoma de una célula deseada.

6. Una célula hospedadora que se ha transformado o transfectado con una secuencia aislada de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4 o un vector de acuerdo con la reivindicación 5, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en células procariotas, células de mamífero, células de levadura, células de insecto, células de anfibio, células vegetales y células fúngicas.

7. La célula hospedadora de la reivindicación 6 que es una célula humana.

8. La célula hospedadora de la reivindicación 6 que se selecciona del grupo que consiste en E. coli, células CHO, células HeLa y células HEK-293.

9. La célula hospedadora de la reivindicación 6 que es una célula cultivada o un explante.

10. Un polipéptido aislado de T1R codificado por la secuencia aislada de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Un ensayo para identificar un compuesto que modula la transducción gustativa que comprende:

12. El ensayo de la reivindicación 11 en el que dicho polipéptido de T1R1 se expresa en una célula o en una membrana celular.

13. El ensayo de la reivindicación 11 en el que dicho polipéptido de T1R1 está comprendido en un soporte de fase sólida.

14. El ensayo de la reivindicación 11 en el que dicho polipéptido de T1R1 está en una solución.

15. El ensayo de la reivindicación 11 en el que dicho T1R1 está unido a polipéptido verde fluorescente.