Un receptor gustativo que comprende al menos un polipéptido de T1R2 y al menos un polipéptido de T1R3,

en elque dicho receptor gustativo se une específicamente a y/o se activa por un estímulo de sabor dulce, en el que dichopolipéptido de T1R2 se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a la SEC ID Nº: 6, un fragmentode este que tiene una longitud de al menos 40 aminoácidos, o un fragmento de una secuencia de aminoácidos quees al menos 90% idéntica a la SEC ID Nº: 6 y que tiene una longitud de al menos 20 aminoácidos;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que, en condiciones de hibridación rigurosas, se hibrida con elcomplemento inverso de la SEC ID Nº: 10; y

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que, en condiciones de hibridación rigurosas, se hibrida con elcomplemento inverso de un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 6;

y en el que dicho polipéptido de T1R3 se selecciona del grupo que consiste en:

(d) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a la SEC ID Nº: 7, un fragmentode este que tiene una longitud de al menos 40 aminoácidos, o un fragmento de una secuencia de aminoácidos quees al menos 90% idéntica a la SEC ID Nº: 7 y que tiene una longitud de al menos 20 aminoácidos;

(e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que, en condiciones de hibridación rigurosas, se hibrida con elcomplemento inverso de la SEC ID Nº: 9; y

(f) un polipéptido codificado por un polinucleótido que, en condiciones de hibridación rigurosas, se hibrida con elcomplemento inverso de un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 7.

Receptores gustativos del dulce hetero-oligoméricos t1r2 -t1r3, líneas celulares que expresan dichos receptores y uso de los mismos para la identificación de compuestos con sabor dulce.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere en parte al descubrimiento de que los receptores T1R se ensamblan para formar receptores gustativos funcionales. En particular, se ha descubierto que la coexpresión de T1R1 y T1R3 da como resultado un receptor gustativo que responde a estímulos del sabor umami, que incluye el glutamato de monosodio. Además, se ha descubierto que la coexpresión de los receptores T1R2 y T1R3 da como resultado un receptor gustativo que responde a estímulos de sabor dulce, que incluyen edulcorantes naturales y artificiales. Además, la presente descripción se refiere al uso de receptores gustativos hetero-oligoméricos que comprenden T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 en ensayos para identificar compuestos que responden respectivamente a estímulos de sabor umami y a estímulos de sabor dulce.

Además, la invención se refiere a la construcción de líneas celular que coexpresan de forma estable o transitoria una combinación de T1R2 y T1R3 en condiciones constitutivas o inducibles.

También se proporciona el uso de estas líneas celulares en ensayos basados en células para identificar compuestos moduladores del sabor umami y dulce, en particular ensayos de selección de alto rendimiento que detectan la actividad de receptores mediante el uso de la formación de imágenes fluorométricas.

Descripción de la técnica relacionada

El documento WO 02/064631 A, citable bajo el artículo 53 (3) EPC, describe receptores gustativos T1R y genes que los codifican.

El sistema gustativo proporciona información sensorial acerca de la composición química del mundo exterior. Se cree que los mamíferos tienen al menos cinco modalidades gustativas básicas: dulce, amargo, ácido, salado, y umami. Véase, por ejemplo, Kawamura et al., Introduction to Umami: A Basic Taste (1987) ; Kinnamon et al.., Ann. Rev. Physiol., 54:715-731 (1992) ; Lindemann, Physiol. Rev., 76:718-766 (1996) ; Stewart et al., Am. J. Physiol., 272:1-26 (1997) . Se cree que cada modalidad gustativa está mediada por un receptor o receptores de proteínas diferenciados que se expresan en las células receptoras gustativas que se encuentran en la superficie de la lengua (Lindemann, Physiol. Rev., 76:718-716 (1996) ) . Los receptores gustativos que reconocen los estímulos de sabor amargo, dulce y umami pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteína G (GPCR) (Hoon et al., Cell, 96:451 (1999) ; Adler et al., Cell, 100:693 (2000) ) . (Se cree que otras modalidades gustativas están mediadas por canales iónicos) .

Los receptores acoplados a proteína G median en muchas otras funciones fisiológicas, tales como la función endocrina, la función exocrina, la frecuencia cardíaca, la lipólisis, y el metabolismo de carbohidratos. El análisis bioquímico y la clonación molecular de una serie de dichos receptores ha revelado muchos principios básicos con respecto a la función de estos receptores. Por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.691.188 describe cómo tras la unión de un ligando a un GPCR, el receptor sufre un cambio conformacional que conduce a la activación de una proteína G heterotrimérica promoviendo el desplazamiento del GDP unido por GTP sobre la superficie de la subunidad Gay la posterior disociación de la subunidad Gade las subunidades G1y Gy. Las subunidades Galibres y los complejos de G1yactivan elementos aguas abajo de una diversidad de vías de transducción de señales.

Esta invención se refiere a la clase T1R de tres miembros de GPCR específicos del gusto. Previamente, se había establecido la hipótesis de que los receptores T1R actuaban como receptores gustativos del dulce (Hoon et al., Cell, 96:541-551 (1999) ; Kitagawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 283:236-242 (2001) ; Max et al., Nat. Genet., 28:58-63 (2001) ; Montmayeur et al., Nat. Neurosci., 4:492-498 (2001) ; Sainz et al., J. Neurochem., 77:896-903 (2001) ) , y en fechas recientes, Nelson et al. (2001) han demostrado que T1R2 y T1R3 de rata actúan en combinación para reconocer los estímulos del sabor dulce. La presente invención se refiere al descubrimiento de que, tal como es el caso de T1R2/T1R3 de rata, T1R2 y T1R3 humanos actúan en combinación para reconocer los estímulos del sabor dulce. Además, la presente descripción se refiere al descubrimiento de que T1R1 y T1R3 humanos actúan en combinación para reconocer los estímulos de sabor umami. Por tanto, es probable que T1R2/T1R3 actúen como un receptor gustativo del dulce, y es probable que T1R1/T1R3 actúen como un receptor gustativo del umami en mamíferos. La explicación probable de la codependencia funcional de T1R1 y T1R3, y de la codependencia funcional de T1R2 y T1R3, es que, al igual que el receptor GABAB, relacionado desde el punto de vista estructural (Jones et al., Nature, 396:5316-5322 (1998) ; Kaupmann et al., Nature, 396:683-687 (1998) ; White et al., Nature, 396:679-682 (1998) ; Kuner et al., Science, 283:74-77 (1999) ) , los T1R actúan como complejos heterodiméricos.

La identificación de la caracterización de los receptores gustativos que actúan como receptores del dulce y del umami es significativa, puesto que facilitará el uso de estos receptores en ensayos para identificar compuestos que modulen (potencien o bloqueen) el sabor dulce y umami. Estos compuestos serían útiles para mejorar el gusto y la palatabilidad de alimentos, bebidas, compuestos medicinales para el consumo humano o animal. En particular, un ensayo que utilice un receptor funcional del dulce permitiría la identificación de nuevos edulcorantes.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de que diferentes combinaciones de T1R, cuando se coexpresan, producen receptores gustativos funcionales que responden a estímulos gustativos. En particular, la presente invención se refiere al descubrimiento de que la coexpresión de T1R2 y T1R3 produce un receptor gustativo heterooligomérico que responde a estímulos gustativos del dulce.

La presente invención también se refiere a líneas celulares que coexpresan T1R2 y T1R3, preferiblemente humanos. En realizaciones preferidas, estas líneas celulares expresarán cantidades elevadas de los receptores, de modo constitutivo o inducible. Estas líneas celulares incluyen células que expresan T1R2 y T1R3 de forma transitoria o estable.

Además, la presente invención proporciona ensayos, preferiblemente ensayos de selección de alto rendimiento, que utilizan el receptor gustativo T1R2/T1R3, preferiblemente ensayos de alto rendimiento basados en células, para identificar compuestos que modulen el sabor dulce o umami. La descripción también proporciona análisis que incluyen ensayos gustativos para confirmar que estos compuestos modulan el sabor dulce.

Objetos

Con este objetivo, es un objeto proporcionar una familia de receptores de mamífero acoplados a proteína G, denominados en la presente memoria T1R, que medie en la percepción gustativa.

Otro objeto es proporcionar fragmentos y variantes de dichos T1R que conserven la actividad, por ejemplo, que se activen y/o se unan a estímulos gustativos del dulce o del umami.

Otro objeto aún más es proporcionar secuencias de ácidos nucleicos o moléculas que codifiquen dichos T1R, fragmentos o variantes de los mismos.

Otro objeto más es proporcionar vectores de expresión que incluyan secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen dichos T1R, fragmentos o variantes de los mismos, que estén unidos operativamente al menos a una secuencia reguladora, tal como un promotor, un potenciador u otra secuencia implicada en la transcripción y/o la traducción de genes positiva o negativa y/o la exportación de proteínas.

Otro objeto más es proporcionar células humanas o no humanas, por ejemplo, células de mamífero, levadura, gusano o insecto, que expresen funcionalmente al menos uno de dichos T1R, o fragmentos o variantes de los mismos, y preferiblemente una combinación de los T1R o fragmentos o variantes de los mismos.

Otro objeto más es proporcionar polipéptidos o proteínas de fusión de T1R que incluyan al menos un fragmento de al menos uno de dichos T1R.

Otro objeto es proporcionar una molécula de ácido nucleico aislada que codifique un polipéptido... [Seguir leyendo]

1. Un receptor gustativo que comprende al menos un polipéptido de T1R2 y al menos un polipéptido de T1R3, en el que dicho receptor gustativo se une específicamente a y/o se activa por un estímulo de sabor dulce, en el que dicho polipéptido de T1R2 se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a la SEC ID Nº: 6, un fragmento de este que tiene una longitud de al menos 40 aminoácidos, o un fragmento de una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la SEC ID Nº: 6 y que tiene una longitud de al menos 20 aminoácidos;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que, en condiciones de hibridación rigurosas, se hibrida con el complemento inverso de la SEC ID Nº: 10; y

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que, en condiciones de hibridación rigurosas, se hibrida con el complemento inverso de un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 6;

y en el que dicho polipéptido de T1R3 se selecciona del grupo que consiste en:

(d) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a la SEC ID Nº: 7, un fragmento de este que tiene una longitud de al menos 40 aminoácidos, o un fragmento de una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la SEC ID Nº: 7 y que tiene una longitud de al menos 20 aminoácidos;

(e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que, en condiciones de hibridación rigurosas, se hibrida con el complemento inverso de la SEC ID Nº: 9; y

(f) un polipéptido codificado por un polinucleótido que, en condiciones de hibridación rigurosas, se hibrida con el complemento inverso de un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 7.

2. El receptor de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de T1R2 y dicho polipéptido de T1R3 derivan de la misma especie o de especies diferentes.

3. El receptor de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de T1R2 y/o el polipéptido de T1R3 derivan de un mamífero, un pez, un reptil, un anfibio o un ave, y se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en hT1R2, hT1R3, rT1R2, rT1R3, mT1R2, mT1R3.

4. El receptor de la reivindicación 1, en el que al menos uno de los polipéptidos de T1R está acoplado a aminoácidos que representan todo o parte de otro receptor acoplado a proteína G.

5. El receptor de la reivindicación 4, en el que todo o parte de otro receptor acoplado a proteína G comprende un dominio extracelular, transmembrana o intracelular.

6. Una composición que contiene un receptor según la reivindicación 4 o la reivindicación 5.

7. Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor gustativo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que está unido operativamente a al menos una secuencia reguladora.

8. Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión según la reivindicación 7, que expresa un receptor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. La célula hospedadora de la reivindicación 8, que se selecciona del grupo que consiste en una célula HEK-293, una célula COS, una célula CHO, y oocitos de Xenopus.

10. La célula hospedadora de la reivindicación 8, que expresa, de forma estable o transitoria, dicho receptor, y que además expresa opcionalmente una proteína G, preferiblemente una proteína G promiscua.

11. Un método para identificar compuestos que modulan la percepción del gusto mediante la identificación de compuestos que se unen a, activan, inhiben y/o modulan un receptor según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el receptor se expresa in vitro en una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

13. El método de la reivindicación 12, en el que dicho compuesto se identifica por su efecto sobre la internalización de receptores, la fosforilación de receptores, o la translocación de la arrestina.

14. El método de la reivindicación 11, en el que dicho compuesto se identifica por su efecto sobre la activación de la proteína G por dicho receptor, la conformación del receptor, los cambios en la concentración intracelular de un segundo mensajero, el potencial de membrana celular, ensayos de transcripción con genes indicadores, o la concentración de calcio intracelular.

15. El método de la reivindicación 12, en el que dicho compuesto agoniza o antagoniza al receptor T1R2/T1R3.

16. El método de la reivindicación 15, en el que la célula expresa de modo inducible el receptor, y en el que el método se utiliza para seleccionar un compuesto que compite con IMP, GMP o sus análogos por la unión con el receptor gustativo del dulce T1R2/T1R3.

17. El método de la reivindicación 15, que es un ensayo de selección de alto rendimiento que emplea instrumentación automática de formación de imágenes fluorométricas.

18. El método de la reivindicación 11, en el que dicho compuesto se identifica por su efecto sobre un animal no humano que expresa los receptores T1R transgénicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

Figura 1: Catálogo de los T1R de ser humano y de rata

Figura 2: El hT1R2 y el hT1R3 se expresan en el epitelio de lengua humana. Los productos de la amplificación específicos de ADNc pueden amplificarse a partir de ADNc preparado de papilas circunvaladas humanas resecadas.

Figura 3: El T1R2/T1R3 humano actúa como un receptor gustativo del dulce

Figura 4: El T1R2 puede controlar la especificidad del ligando de T1R2/T1R3

Figura 7: Los restos clave de unión al ligando de mGluR1 se conservan en el T1R1

Figura 8: El T1R1/T1R3 humano actúa como un receptor gustativo del umami

Figura 9: El PDZIP facilita la expresión del T1R2 humano en la superficie.

A. La tinción de inmunofluorescencia del hT1R2 marcado con Myc indica que el PDZIP aumenta significativamente la cantidad de proteína de T1R2 humana sobre la membrana plasmática.

B. Los datos del análisis FACS demuestran el mismo resultado. T1R2 humano marcado con Myc: línea verde;

C. T1R2 humano marcado con Myc con PDZIP: línea negra.

Figura 10: Los datos de formación de imágenes de calcio demuestran las respuestas de hT1R2/hT1R3 a una serie de estímulos dulces

Figura 16: El lactisol inhibe los receptores del dulce T1R2/T1R3 y del umami T1R1/T1R3 y el sabor dulce y umami. (Panel izquierdo) se muestran las respuestas de células HEK-G 15 transfectadas de forma transitoria con T1R1/T1R3 (círculos) a L-glutamato 10 mM, y células HEK-Ga15 transfectadas de forma transitoria con T1R2/T1R3 (cuadrados) a sacarosa 150 mM, en presencia de concentraciones variables de lactisol. (Panel derecho) se muestran los aumentos en nº de veces en los umbrales de detección del gusto

en presencia de lactisol 1 y 2 mM para los estímulos de sabor dulce, sacarosa y D-triptófano, los estímulos de sabor umami, L-glutamato (MSG) y L-glutamato más IMP 0, 2 mM, y cloruro de sodio. Los umbrales de detección se determinaron siguiendo el método de Schiffman et al.