Detección y cuantificación multiplex de ácidos nucleicos microbianos controlada de forma interna.

Un método para detectar y cuantificar un ácido nucleico microbiano en una muestra biológica,

y dicho método comprende:

a) proporcionar una mezcla de reacción que comprende uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos, dos o más pares de cebadores, siendo dichos pares de cebadores específicos para diferentes porciones de secuencia de dicho ácido nucleico microbiano, y uno o más pares de cebadores específicos para dicho uno o más ácidos nucleicos estándar,

b) añadir dicha muestra biológica a dicha mezcla de reacción,

c) realizar uno o más ciclos, en los que un ciclo comprende un paso de amplificación, y dicho paso de amplificación comprende obtener dos o más productos de amplificación diferentes derivados de dicho ácido nucleico microbiano si se encuentra presente en dicha muestra y producir uno o más productos de amplificación derivados de dicho uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos

d) detectar y medir las señales detectables generadas por dichos productos de amplificación y que son 15 proporcionales a su concentración en dicha mezcla de reacción, en la que la presencia o ausencia de la señal detectable o señales generadas por dicho ácido nucleico microbiano es indicativa de la presencia o ausencia del ácido nucleico microbiano en dicha muestra biológica

e) determinar la cantidad de dicho ácido nucleico microbiano en dicha muestra biológica en comparación a las señales generadas por dicho ácido nucleico microbiano y dicho uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos, en los que dichas dos o más porciones de secuencia diferentes del ácido nucleico microbiano son LTR y GAG del VIH.

Detección y cuantificación multiplex de ácidos nucleicos microbianos controlada de forma interna Campo de la invención La presente invención está relacionada con nuevos métodos y usos para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos microbianos utilizando una referencia cuantitativa interna. Los métodos preferibles están basados en la amplificación de ácidos nucleicos, preferiblemente mediante la en reacción en cadena de la polimerasa. Además se proporcionan equipos que comprenden componentes para realizar dichos métodos y usos.

Antecedentes de la invención En el área del diagnóstico molecular, la detección y cuantificación de ácidos nucleicos microbianos utilizando reacciones de amplificación de los ácidos nucleicos tiene un papel significativo. El cribado rutinario de la presencia del virus de la inmunodeficiencia humano (VIH) , el virus de la hepatitis B (VHB) y/o C (VHC) en las donaciones de sangre es un ejemplo de aplicación a gran escala de las reacciones de amplificación y detección de ácidosnucleicos. Éstas comprenden una variedad de diferentes técnicas, siendo la más comúnmente utilizada la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) introducida por Kar y Mullis en 1984.

Los sistemas automatizados para el análisis basado en la PCR a menudo utilizan la detección a tiempo real del producto de amplificación durante el proceso de PCR. La clave de tales métodos es la utilización de oligonucleótidos modificados que son portadores de grupos marcador o marcajes.

La amplificación se realiza típicamente con la reacción en cadena de la polimerasa, que específicamente amplifica los ácidos nucleicos diana hasta cantidades detectables. Otras posibles reacciones de amplificación comprenden, entre otros, la reacción en cadena de la ligasa, reacción en cadena de la polimerasa ligasa, Gap-LCR, reacción de reparado de la cadena, 3SR, NASBA, amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA) , amplificación mediada por transcripción (TMA) y amplificación Q®.

La detección de un ácido nucleico microbiano en una muestra biológica es crucial por ejemplo para reconocer una infección en un individuo. Por lo tanto, un requisito importante de un ensayo para la detección de una infección microbiana es que debe evitar los resultados falsos negativos debidos a las regiones de secuencia variables de un genoma microbiano causadas por las mutaciones. Por ejemplo, los individuos infectados con VIH están en la fase más contagiosa durante las etapas virémicas tempranas de infección. Tras alcanzarse la respuesta inmune específica del VIH, la viremia en plasma se reduce. El periodo asintomático se caracteriza por una viremia en plasma persistente, de bajo nivel. Las secuencias mutadas o parcialmente mutadas del genoma viral que posiblemente no se amplifican y/o detectan, en combinación con la baja carga viral aumentan la posibilidad de obtener resultados falsos negativos.

Siddappa et al. (J. Clin. Microbiol. 42, (2004) , 2742- 2751) y Herrmann et al. (J. Clin. Microbiol. 42, (2004) , 19091914) , o US 2004/0229211 utilizan la aproximación en la que más de una región se amplifica mediante PCR y se detecta a continuación.

Además de la mera detección de la presencia o ausencia de un ácido nucleico microbiano en una muestra, a menudo es importante determinar la cantidad de dicho ácido nucleico. La fase y gravedad de una enfermedad vírica puede valorarse en base a la carga viral. Además, el seguimiento de cualquier terapia requiere información sobre la cantidad de un virus presente en un individuo con el fin de evaluar el éxito de la terapia. Las referencias mencionadas anteriormente, que tratan de la detección of ácidos nucleicos microbianos mediante el ataque simultaneo de múltiples porciones de secuencia de los respectivos microorganismos, utilizan todos ellos una calibración externa para cuantificar la presencia de dichos ácidos nucleicos, es decir se crean curvas estándar en reacciones separadas en las que se usan cantidades conocidas de ácidos nucleicos idénticos o comparables. La cantidad absoluta de un ácido nucleico microbiano se determina a continuación por comparación del resultado obtenido con la muestra analizada con dicha función estándar. Sin embargo, la calibración externa posee la desventaja de que un posible procedimiento de extracción, con eficacia variable, y la posible y a menudo no predecible presencia de agentes inhibidores de la reacción de amplificación y/o detección no se toman en consideración. Esta circunstancia también aplica a cualquier otro efecto relacionado con la muestra. Por lo tanto, puede darse el caso de que una muestra se juzgue como negativa debido a un procedimiento de extracción fallido u otros factores basados en la muestra, a pesar de que el ácido nucleico microbiano a detectar y cuantificar se encuentra en realidad presente en la muestra.

Por lo tanto, existe la necesidad en la materia de proporcionar un método simple y fiable para la detección y cuantificación de un ácido nucleico microbiano.

Descripción de la invención La presente invención está relacionada con nuevos métodos y utilizaciones para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos microbianos utilizando una o más referencias cualitativas internas. Brevemente, las porciones de múltiples secuencias de un ácido nucleico microbiano se amplifican y detectan de forma simultanea junto con dicha referencia cuantitativa interna en la misma mezcla de reacción, lo que permite la cuantificación del ácido nucleico microbiano. Así, un sujeto de la presente invención es:

Un método para detectar y cuantificar un ácido nucleico microbiano en una muestra biológica, y dicho método comprende:

a) proporcionar una mezcla de reacción que comprende uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos, dos o más pares de cebadores, y dichos pares de cebadores son específicos para diferentes porciones de secuencia de dicho ácido nucleico microbiano, y uno o más pares de cebadores específicos para dicho uno o más ácidos nucleicos estándar

b) añadir dicha muestra biológica a dicha mezcla de reacción c) realizar uno o más ciclos, en los que un paso de ciclado comprende un paso de amplificación, y dicho paso de amplificación comprende la producción de dos o más productos de amplificación diferentes derivados de dicho ácido nucleico microbiano si se encuentra presente en dicha muestra y la producción de uno o más productos de amplificación derivados de dicho uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos d) detectar y medir las señales detectables generadas por dichos productos de amplificación y que son proporcionales a su concentración en dicha mezcla de reacción, en la que la presencia o ausencia de la señal detectable generada por dicho ácido nucleico microbiano es indicativa de la presencia o ausencia del ácido nucleico microbiano en dicha muestra biológica

e) determinar la cantidad de dicho ácido nucleico microbiano en dicha muestra biológica por comparación de las señales generadas por dicho ácido nucleico microbiano y dichos uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos, en la que dichos dos o más porciones de secuencia diferentes del ácido nucleico microbiano son porciones de secuencia del mismo microorganismo.

El método de acuerdo con la invención aporta una serie de mejoras en la materia:

El aprovechamiento de más de una porción de la secuencia de un ácido nucleico microbiano da lugar a un riesgo significativamente reducido de infravalorar los títulos microbianos, y al mismo tiempo se reduce el riesgo de infravalorar los títulos de aislamientos microbianos desconocidos. Todos los genotipos diferentes dentro de un organismo dado pueden detectarse y cuantificarse fácilmente utilizando un número mínimo de oligonucleótidos como resultado de la sensibilidad reducida a la variabilidad de la eficiencia de la amplificación.

El ciclo de vida de las pruebas formuladas de acuerdo con la Invención se prolonga, ya que es capaz de hacer frente incluso con nuevas variantes generadas por microorganismos como los virus a través de la presión selectiva, por ejemplo como consecuencia de nuevos fármacos anti-retrovirales.

La sensibilidad global se aumenta significativamente, y la variabilidad de las determinaciones del título se minimiza debido a la detección y cuantificación simultanea de múltiples porciones de secuencia diferentes.

Utilizando uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos "internos" de acuerdo con el método o métodos de la invención, se nivelan los efectos inhibitorios específicos de muestra, pero también los inespecíficos de muestra que posiblemente interfieren con las reacciones de amplificación y... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar y cuantificar un ácido nucleico microbiano en una muestra biológica, y dicho método comprende:

a) proporcionar una mezcla de reacción que comprende uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos, dos o más pares de cebadores, siendo dichos pares de cebadores específicos para diferentes porciones de secuencia de dicho ácido nucleico microbiano, y uno o más pares de cebadores específicos para dicho uno o más ácidos nucleicos estándar, b) añadir dicha muestra biológica a dicha mezcla de reacción, c) realizar uno o más ciclos, en los que un ciclo comprende un paso de amplificación, y dicho paso de amplificación comprende obtener dos o más productos de amplificación diferentes derivados de dicho ácido nucleico microbiano si se encuentra presente en dicha muestra y producir uno o más productos de amplificación derivados de dicho uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos d) detectar y medir las señales detectables generadas por dichos productos de amplificación y que son proporcionales a su concentración en dicha mezcla de reacción, en la que la presencia o ausencia de la señal detectable o señales generadas por dicho ácido nucleico microbiano es indicativa de la presencia o ausencia del ácido nucleico microbiano en dicha muestra biológica e) determinar la cantidad de dicho ácido nucleico microbiano en dicha muestra biológica en comparación a las señales generadas por dicho ácido nucleico microbiano y dicho uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos, en los que dichas dos o más porciones de secuencia diferentes del ácido nucleico microbiano son LTR y GAG del VIH.

2. El método de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende en el paso a) proporcionar dos o más sondas específicas para las diferentes porciones de secuencia amplificadas mediante dichos dos o más pares de cebadores específicos de diferentes de porciones secuencia de dicho ácido nucleico microbiano, y una o más sondas específicas de la porción o porciones de secuencia amplificadas mediante dicho uno o más pares de cebadores específicos de dicho uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos.

3. El método de la reivindicación 2, que adicionalmente comprende en el paso c) un paso de hibridación que està comprendido en dicho ciclo, en el que dicho paso de hibridación comprende la hibridación de diferentes porciones de secuencia amplificadas mediante dichos dos o más pares de cebadores específicos de diferentes porciones de secuencia de dicho ácido nucleico microbiano, si el ácido nucleico microbiano está presente en dicha muestra, con dichas dos o más sondas, y la hibridación de dicha porción o porciones de secuencia amplificadas mediante dicho uno o más pares de cebadores específicos para dicho uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos con una

o más sondas, en la que las sondas están marcadas con una porción donadora de fluorescencia y la porción correspondiente aceptora de fluorescencia, en el paso d) detectar la presencia o ausencia de transferencia de la energía de resonancia de la fluorescencia (FRET) entre dicha porción donadora de fluorescencia y dicha porción aceptora de fluorescencia de dicha sonda, en la que la presencia o ausencia de fluorescencia generada por dicho ácido nucleico microbiano es indicativo de la presencia o ausencia del ácido nucleico microbiano en dicha muestra biológica, en el paso e) determinar la cantidad de dicho ácido nucleico microbiano en dicha muestra por comparación de las señales fluorescentes generadas por dicho ácido nucleico microbiano y dichos ácidos nucleicos estándares cuantitativos.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la amplificación de una o más de dichas porciones de secuencia diferentes del ácido nucleico microbiano y dicho uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos con el mismo par de cebadores.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la amplificación de dichas porciones de secuencia diferentes del ácido nucleico microbiano y dichos uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos con diferentes pares de cebadores.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende utilizar un colorante fluorescente como marca detectable de los productos de amplificación derivados de dichos dos o más porciones de secuencia diferentes del ácido nucleico microbiano, y un colorante fluorescente diferente como marca detectable para el producto o productos de amplificación derivados de dicho uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende la utilización de un colorante fluorescente distinto como marca detectable para cada uno de los productos de amplificación derivados del ácido nucleico microbiano, y un colorante fluorescente diferente como marca detectable para el producto o productos de amplificación derivados de dichos uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos, en el que el paso de cuantificación comprende cuantificar de forma separada cada una de las porciones de secuencia amplificadas de la secuencia diana microbiana.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que exactamente un ácido nucleico estándar cuantitativo está presente en la mezcla de reacción.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las secuencias de ácido nucleico de dicho uno o más cebadores son de al menos 12 nucleótidos contiguos seleccionados a partir del grupo de Id. de Sec. Nº 116 .

2. 27 o las correspondientes secuencias de ácido nucleico complementarias de las mismas.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en el que las secuencias de ácido nucleico de dichas dos o más sondas son de al menos 12 nucleótidos contiguos seleccionados de entre el grupo de Id. de Sec. Nº 17-20, 28, 29 o las correspondientes secuencias de ácido nucleico complementarias de las mismas.

11. La utilización de un ácido nucleico estándar cuantitativo para detectar y cuantificar un ácido nucleico microbiano 10 de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

12. Un equipo para detectar y cuantificar un ácido nucleico microbiano en una muestra biológica mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y dicho equipo comprende uno o más ácidos nucleicos estándares cuantitativos, dos o más pares de cebadores, y dichos pares de cebadores son específicos para diferentes porciones de secuencia de dicho ácido nucleico microbiano, y uno o más pares de cebadores específicos para dicho uno o más ácidos nucleicos estándar, en el que dichas dos o más porciones de secuencia diferentes del ácido nucleico microbiano son LTR y GAG del VIH.