Derivados de 5,6-dihidroxi-isoindol como conectores para la síntesis de oligómeros en fase sólida.

Compuesto de Fórmula I:**Fórmula**

en la que:

uno de entre A' y A" es SM o L-SM,

SM es un medio de soporte;

L es un resto de unión,

el otro de entre A' y A" es H o un sustituyente;

cada uno de Ru, Rv, Rw, Rx, Ry y Rz es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquiniloo alquinilo sustituido;

Y1 e Y2 son cada uno independientemente del otro O, S, NR1 CH2 o CR1R1: R1 es H, alquilo, alquilosustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo o alquinilo sustituido;

G1 es O, S o NR';

en la que R' es H o un sustituyente;

Q es H, un resto nucleosidilo, un resto nucleosidilo protegido, un resto nucleosidilo unido a través de unconector, un oligonucleotidilo protegido o un resto oligonucleotidilo, o un grupo protector; y

dicho conector es un resto triéster de fosfitidilo, fosfodiéster, diéster de fosforotioato o fosfotriéster.

Derivados de 5, 6-dihidroxi-isoindol como conectores para la síntesis de oligómeros en fase sólida

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación proporciona una descripción acerca de compuestos, composiciones y métodos de uso relacionados con la síntesis de oligómeros. Por ejemplo, la divulgación proporciona soportes para la síntesis de oligonucleótidos y oligonucleótidos modificados, composiciones que comprenden tales soportes y métodos de uso de tales soportes en la síntesis de oligonucleótidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los oligonucleótidos han sido utilizados en diversas aplicaciones biológicas y bioquímicas. Se han utilizado como cebadores y sondas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , como agentes antisentido utilizados en la validación de dianas, descubrimiento y desarrollo de fármacos, como ribozimas, como aptámeros, y como estimuladores generales del sistema inmunitario. Al haber aumentado la popularidad de los oligonucleótidos, ha aumentado a mismo ritmo la necesidad de producir lotes de mayor tamaño, y mayores cantidades de lotes de pequeño tamaño. Además, ha habido un creciente énfasis en la reducción de los costes de la síntesis de oligonucleótidos, y la mejora de la pureza y el aumento del rendimiento de los productos oligonucleotídicos.

Se han introducido una serie de innovaciones en la técnica de la síntesis de oligonucleótidos. Entre estas innovaciones se encuentran el desarrollo de grupos protectores ortogonales, activadores, reactivos y condiciones de síntesis excelentes. Los propios oligonucleótidos han sido objeto de una gran variedad de modificaciones y mejoras. Entre éstas se encuentran las químicas que mejoran la afinidad de un oligonucleótido por una diana específica, que mejora la estabilidad de un oligonucleótido in vivo, que mejora las propiedades farmacocinéticas (PK) y toxicológicas (Tox) de un oligonucleótido, etc. Estas químicas novedosas implican generalmente una modificación química de una o más de las partes constituyentes del oligonucleótido.

El término "oligonucleótido" abarca así una clase de compuestos que incluyen oligonucleótidos naturales, así como modificados. Tanto los oligonucleótidos naturales como los modificados han demostrado ser útiles en diversos escenarios, y ambos pueden crearse mediante procesos similares, realizándose modificaciones apropiadas para dar cuenta de las modificaciones específicas adoptadas. Puede concebirse un oligonucleótido natural, es decir, una hebra corta de ADN o ARN, como un miembro de las siguientes fórmulas genéricas, denominadas oligo-ARN y oligo-ADN, respectivamente, que se presentan a continuación:

en las que m es un número entero de 1 a aproximadamente 100, y Bx es una de las bases nitrogenadas naturales.

A pH fisiológico, un oligonucleótido se produce como anión, ya que el fosfato se disocia fácilmente a pH neutro, y un oligonucleótido se producirá generalmente en fase sólida, sea amorfo o cristalino, como una sal. Por lo tanto, a menos que se modifique de otra manera, el término "oligonucleótido" abarca cada una de las formas aniónica, de sal y de ácido libre anteriormente mencionadas.

En esencia, un oligonucleótido natural puede concebirse como un oligómero de m subunidades monoméricas representadas por los siguientes nucleótidos:

en los que cada Bx es una base nitrogenada, en los que el último resto es un nucleósido (es decir, un nucleótido sin el grupo fosfato 3’) .

Como se ha mencionado anteriormente, se han realizado a los oligonucleótidos diversas modificaciones químicas, con el fin de mejorar su afinidad, estabilidad, PK, Tox, y otras propiedades. En general, el término oligonucleótido, tal como se utiliza actualmente en la técnica, abarca, entre otros, los compuestos de fórmula:

en la que m es un número entero de 1 a aproximadamente 100, cada uno de G1 es O o S, cada G2 es OH o SH, cada G3 es O, S, CH2 o NH, cada G5 es un resto divalente tal como O, S, CH2, CFH, CF2, -CH=H-, etc., cada R2’ es H, OH, O-rg, en la que rg es un grupo protector eliminable, un sustituyente 2’, o junto con R4' forma un puente, cada R3’ es H, un sustituyente, o junto con R4’ forma un puente, cada R4' es H, un sustituyente, junto con R2’ forma un puente, junto con R3’ forma un puente, o junto con R5’ forma un puente, cada q es 0 ó 1, cada uno de R5’ es H, un sustituyente, o junto con R4' forma un puente, cada G6 es O, S, CH2 o NH, y cada G7 es H, PO3H2, o un grupo conjugado, y cada Bx es una base nitrogenada, tal como se describe en el presente documento (es decir, natural o modificada) .

Los métodos convencionales de síntesis de oligonucleótidos incluyen los métodos en fase sólida descritos por primera vez por Caruthers et al. (Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.750.666, que se incorpora en el presente documento por referencia, especialmente las columnas 3-58, en las que se describen los materiales de partida y los métodos generales de preparación de oligonucleótidos, y especialmente los oligonucleótidos de fosforotioato, cuyas partes se incorporan específicamente en el presente documento por referencia) . Estos métodos fueron mejorados más tarde por Köster et al. (Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº RE 34.069, que se incorpora en el presente documento por referencia, especialmente las columnas, en las que se describen, cuyas partes se incorporan específicamente en el presente documento por referencia) . Estos métodos han sido mejorados adicionalmente por varios inventores, como se analiza con más detalle más adelante. Los métodos de síntesis de ARN se describen, entre otros, en las patentes de EE.UU. Nos 6.111.086, 6.008.400, y 5.889.136, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento en su totalidad. Resultan especialmente pertinentes las columnas 7-20 del documento EE.UU. 6.008.400, que se incorporan expresamente en el presente documento por referencia.

El proceso general de fabricación de un oligonucleótido por el método de Köster et al. puede describirse de la siguiente manera:

En primer lugar, se prepara un cebador de síntesis por unión covalente de un nucleósido adecuado a un medio de soporte sólido (SS) a través de un conector. Un cebador de síntesis de este tipo es el siguiente:

en el que SS es el medio de soporte sólido, LL es un grupo de unión que une el nucleósido al medio de soporte sólido por medio de G3. El grupo de unión es generalmente un grupo bifuncional, une covalentemente el nucleósido 3’ terminal (y por lo tanto el oligonucleótido naciente) al medio de soporte sólido durante la síntesis, pero que se escinde en condiciones ortogonales a las condiciones en las que se elimina el grupo protector 5’, y si procede, cualquier grupo protector 2’. T’ es un grupo protector eliminable, y las restantes variables ya han sido definidas, y se describen con más detalle en el presente documento. Los cebadores de síntesis adecuados pueden adquirirse en Amersham Biosciences con el nombre comercial Primer Support 200™. A continuación, el medio de soporte que tiene el cebador de síntesis unido al mismo puede hincharse en un disolvente adecuado, por ejemplo acetonitrilo, e introducirse en una columna de un instrumento de síntesis en fase sólida adecuado, tal como uno de los sintetizadores disponibles en Amersham Biosciences, tal como un sintetizador de ADN/ARN de la marca AKTA OligoPilot™ u OligoProcess™.

La síntesis se lleva a cabo del extremo 3’ al 5’ del oligómero. En cada ciclo, se llevan a cabo las siguientes etapas:

(1) eliminación de T’, (2) acoplamiento, (3) oxidación, (4) protección terminal. Cada una de las etapas (1) - (4) puede ir, y generalmente va, seguida de una o más etapas de lavado, de manera que se introduce en la columna un disolvente limpio para lavar los materiales solubles de la columna, empujar los reactivos y/o activadores a través la columna, o ambos. Las etapas (1) - (4) están representadas a continuación:

En general, T’ se selecciona para ser eliminable en condiciones ortogonales a las utilizadas para escindir el oligonucleótido del medio de soporte sólido al final de la síntesis, así como las utilizadas para eliminar otros grupos protectores utilizados durante la síntesis. Un grupo protector para la síntesis de oligonucleótidos reconocido en la técnica es DMT (4, 4’-dimetoxitritilo) . El grupo DMT resulta especialmente útil ya que es eliminable en condiciones débilmente ácidas. Por lo tanto, un reactivo de eliminación aceptable es DCA al 3% en un disolvente adecuado, tal como acetonitrilo. El disolvente de lavado, si se utiliza, puede... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de Fórmula I:

en la que:

uno de entre A’ y A” es SM o L-SM, SM es un medio de soporte; L es un resto de unión, el otro de entre A’ y A” es H o un sustituyente; cada uno de Ru, Rv, Rw, Rx, Ry y Rz es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo

o alquinilo sustituido; Y1 e Y2 son cada uno independientemente del otro O, S, NR1 CH2 o CR1R1: R1 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo o alquinilo sustituido; G1 es O, S o NR’; en la que R' es H o un sustituyente; Q es H, un resto nucleosidilo, un resto nucleosidilo protegido, un resto nucleosidilo unido a través de un conector, un oligonucleotidilo protegido o un resto oligonucleotidilo, o un grupo protector; y dicho conector es un resto triéster de fosfitidilo, fosfodiéster, diéster de fosforotioato o fosfotriéster.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que cada uno de Y1 e Y2 es O.

3. Compuesto según la reivindicación 1, en el que al menos uno de Y1 e Y2 es O.

4. Compuesto según la reivindicación 1, en el que A” es fenilo.

5. Compuesto según la reivindicación 1, en el que A” es L-SM.

6. Compuesto según la reivindicación 1, en el que A’ es L-SM.

7. Compuesto según la reivindicación 1, que tiene la fórmula:

en la que SS es un medio de soporte sólido y pg es un grupo 4, 4’-dimetoxitrifenilmetilo o un grupo pixilo opcionalmente sustituido adicionalmente.

8. Compuesto según la reivindicación 1, que tiene la fórmula:

en la que SS es un medio de soporte sólido.

9. Compuesto según la reivindicación 1, que tiene la fórmula:

en la que NS es un resto de un nucleósido opcionalmente protegido y SS es un medio de soporte sólido.

10. Compuesto según la reivindicación 1 que tiene la fórmula:

en la que Y es alquileno, cicloalquileno, arileno, heteroarileno, arilalquileno, alcarileno, o alquilenarilalquileno y SS es un medio de soporte sólido.

11. Compuesto según la reivindicación 1 de fórmula:

en la que G1 es O, R1 es fenilo; R3 es un resto de unión conectado a un medio de soporte sólido; y R4 es un miembro del grupo que consiste en H, un grupo protector, y un nucleósido unido a través un enlace fosfodiéster, fosforotioato o fosforamidato, nucleósido que está opcionalmente protegido en la posición 5’ o unido a uno o más nucleósidos adicionales a través de un conector internucleosídico.

12. Compuesto según la reivindicación 1 de fórmula:

en la que G1 es O, S o NR2, R2 es un sustituyente; y R1 es arilo, cicloalquilo, cicloalquilo insaturado, alquilo, alquilo insaturado, heterociclilo, heterociclilo insaturado, heteroarilo o acilo, en la que R1 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes; R3 es un resto de unión conectado a un medio de soporte sólido; y R4 es un miembro del grupo que consiste en H, un grupo protector, y un nucleósido unido a través de un conector fosforamidato, fosfodiéster o fosforotioato, nucleósido que está opcionalmente protegido en la posición 5’ o unido a uno o más nucleósidos adicionales a través de un conector internucleosídico.

13. Compuesto según la reivindicación 11, en el que R4 es H.

14. Compuesto según la reivindicación 11, en el que R4 es un nucleósido unido a través de un conector fosforamidato, fosfodiéster o fosforotioato, en el que dicho nucleósido está opcionalmente protegido con un grupo protector.

15. Compuesto según la reivindicación 11, en el que R4 es un nucleósido unido a través de un conector fosforamidato, fosfodiéster o fosforotioato, en el que dicho nucleósido tiene un grupo 5’-OH libre.

16. Compuesto según la reivindicación 11, en el que R4 es un nucleósido protegido en 5’ unido a través de un conector fosforamidato, fosfodiéster o fosforotioato.

17. Compuesto según la reivindicación 11, en el que R4 es un nucleósido unido a través de un conector fosforamidato, fosfodiéster o fosforotioato, en el que dicho nucleósido está conectado a uno o más nucleósidos adicionales a través de un conector internucleosídico adecuado.

18. Compuesto según la reivindicación 1 que tiene la fórmula:

en la que:

SM es un medio de soporte; L1 es un resto de unión; G1 es O, S, NR2; R2 es distinto de H; Q es H o pg; pg es un grupo protector; y R1 es un grupo bloqueante.

19. Compuesto según la reivindicación 18 en el que SM es un material de soporte sólido.

20. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19 en el que L1 es C (=O) - (CH2) 2-C (=O) .

21. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 en el que G1 es O.

22. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 en el que Q es H.

23. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 en el que Q es un grupo protector.

24. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23 en el que G1 es O y R1 es un grupo alquilo, arilo, acilo, aralquilo, arilacilo, cicloalquilo, heteroarilo o heteroarilacilo opcionalmente sustituido adicionalmente.

25. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24 en el que R1 es arilo en el que dicho grupo arilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre F, Cl, Br, I, O- (alquilo C1-C12) , O- (acilo C1-C12) , NO2, heteroarilo, alquilo y acilo.

26. Compuesto según la reivindicación 25 en el que R1 es fenilo o fenilo sustituido.

27. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 en el que R1 es un grupo alquilo seleccionado de entre metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo, i-butilo, n-pentanilo, isooctanilo y dodecanilo en el que dicho grupo alquilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre F, Cl, Br, I, O- (alquilo C1-C12) , O- (acilo C1-C12) , NO2, arilo y heteroarilo.

28. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que R1 es un grupo acilo seleccionado de entre formilo, acetilo, propanoílo, butanoilo y octanoilo en el que dicho grupo acilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre F, Cl, Br, I, O- (alquilo C1-C12) , NO2, arilo o heteroarilo.

29. Compuesto según la reivindicación 1 que tiene la fórmula:

30. Proceso de preparación del compuesto según la reivindicación 1 que tiene la Fórmula I que comprende hacer reaccionar un compuesto de Fórmula II con un compuesto de Fórmula III:

NH2A” III.

31. Proceso según la reivindicación 30, que comprende adicionalmente sintetizar un compuesto de Fórmula II por reacción de Diels-Alder a partir de dienófilo IV y dieno V:

para formar un producto intermedio A: añadir grupos hidroxilo a través del doble enlace para formar el producto intermedio B:

y derivatizar el producto intermedio B para formar un compuesto de Fórmula II.

32. Proceso de preparación del compuesto según la reivindicación 1 que tiene la Fórmula I que comprende hacer reaccionar dienófilo IVa con dieno V para formar el producto intermedio AA:

añadir grupos hidroxilo a través del doble enlace a para formar el producto intermedio BB:

y derivatizar el producto intermedio BB para formar un compuesto de Fórmula I.