Métodos para sintetizar oligonucleótidos sulfurados.

Un método para la preparación de oligonucleótidos de fosforotioato,

cuyo método consiste en: fosfitilar el 5''-hidroxilo de un resto de ácido nucleico en acetonitrilo para formar un intermediario fosfito, estando unido dicho resto de ácido nucleico a un soporte sólido, y oxidar dicho intermediario fosfito con un disulfuro de acetilo en un sistema solvente consistente en acetonitrilo y piridina, piridina estéricamente bloqueada o una mezcla de éstos, durante un tiempo suficiente para efectuar la conversión de dicho intermediario fosfito a dicho fosforotioato.

Mïtodos para sintetizar oligonucleïtidos sulfurados

CAMPO DE LA INVENCIïN

La presente invenciïn se dirige a mïtodos para sintetizar oligonucleïtidos sulfurados y anïlogos de los mismos. Los mïtodos emplean un reactivo de disulfuro de fenilacetilo en un sistema solvente simplificado y producen oligonucleïtidos que tienen grupos fosforotioato con gran eficiencia y mejores rendimientos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIïN

Los oligonucleïtidos modificados son de gran valor en la investigaciïn biolïgica molecular y en aplicaciones tales como la terapia antivïrica. Los oligonucleïtidos modificados que pueden bloquear la traducciïn de ARN y que son resistentes a las nucleasas son ïtiles como reactivos antisentido. Los oligonucleïtidos sulfurados, que contienen uniones fosforotioato (P-S) , tienen interïs en estas ïreas. Los oligonucleïtidos que contienen fosforotioato son tambiïn ïtiles en la determinaciïn de las rutas estereoquïmicas de ciertas enzimas que reconocen ïcidos nucleicos.

Se han aplicado tïcnicas estïndar para la sulfurizaciïn de compuestos que contienen fïsforo a la sïntesis de oligonucleïtidos sulfurados. Como ejemplos de reactivos sulfurizantes que han sido utilizados para sintetizar oligonucleïtidos que contiene enlaces fosoforotioato, se incluyen azufre elemental, tetrasulfuro de dibenzoïlo, 1, 1-diïxido de 3-H-1, 2-benziditiol-3-ona (tambiïn conocido como reactivo de Beaucage) , disulfuro de tetraetiltiouramilo (“TETD”) y disulfuro de bis (O, O-diisopropoxifosfinotioïlo) (conocido como reactivo de Stec) . La mayorïa de los reactivos sulfurizantes, sin embargo, presentan uno o mïs inconvenientes significativos.

El azufre elemental presenta problemas y no es adecuado para automatizaciïn debido a su insolubilidad en la mayorïa de los solventes orgïnicos. Mïs aïn, el disulfuro de carbono, una fuente preferida de azufre, tiene una volatilidad indeseable y un punto de inflamaciïn indeseablemente bajo. Con frecuencia, se observan productos colaterales indeseados con el uso del tetrasulfuro de dibenzoïlo. El reactivo de Beaucage, aun siendo un reactivo de sulfurizaciïn relativamente eficiente, es difïcil de sintetizar y no es particularmente estable. Mïs aïn, el reactivo de Beaucage forma un producto de reacciïn secundario que es un potente agente oxidante.

(R.P. Iyer y col., J. Am. Chem. Soc. 112, pp. 1253-1254 (1990) ; R.P. Iyer y col., J. Org. Chem. 55, 4693-4699 (1990) ) . ïste puede ademïs dar lugar a productos colaterales no deseados que pueden ser difïciles de separar del producto de reacciïn deseado. El disulfuro de tetraetiltiouramilo, aun siendo relativamente barato y estable, tiene una velocidad de reacciïn de sulfurizaciïn que puede ser indeseablemente lenta.

Se describe un mïtodo para producir un ïster de fosforotioato por reacciïn de un ïster de fosfito con un disulfuro de acilo en la solicitud de patente Holandesa Nï 8902521. El mïtodo descrito es aplicado a un dïmero de fosfotriïster purificado utilizando quïmica de fase de soluciïn. El mïtodo es intensivo en cuanto a tiempo y en cuanto a trabajo, en el sentido de que sïlo mostrï funcionar en un esquema complejo que conllevaba realizar la primera etapa de sïntesis (formaciïn de un fosfito) en acetonitrilo, eliminar el acetonitrilo, purificar el fosfotriïster intermedio y proceder con la sulfurizaciïn en una mezcla de solventes de dicloroetano (DCE) y 2, 4, 6colidina. Mïs aïn, el mïtodo fue sïlo demostrado con un nucleïtido. No se hizo sugerencia alguna de que el mïtodo Holandïs pudiera ser empleado con estructuras de ïcido nucleico mayores, de que el mismo pudiera emplear un solvente comïn a travïs de todas las etapas de sïntesis, de que se pudieran obtener mejores resultados o de que el

mïtodo pudiera ser adaptado para la sïntesis automatizada convencional sin grandes modificaciones del esquema de automatizaciïn. Aunque se cita el acetonitrilo como uno de los diversos solventes posibles, no se demostrï la utilidad del mïtodo para llevar a cabo todas las etapas de la sïntesis en acetonitrilo como solvente comïn. Aunque otras publicaciones (Kamer y col., Tetrahedron Letters 30 (48) , pp. 6757-6760 (1989) ; Roelen y col., Rech. Trav. Chim. Pays-Bas 110, pp. 325-331 (1991) ) muestran la sulfurizaciïn de oligïmeros que tienen hasta 6 nucleïtidos, los inconvenientes anteriores no son resueltos por los mïtodos descritos en estas referencias.

Por lo tanto, sigue habiendo necesidad de mïtodos y reactivos mejorados para preparar grupos fosforosos que contienen azufre, tales como uniones fosforotioato, en oligonucleïtidos y otros compuestos orgïnicos. La presente invenciïn se dirige a estos, asï como a otros, fines importantes.

RESUMEN DE LA INVENCIïN

La presente invenciïn proporciona mïtodos para la sïntesis de oligonucleïtidos de fosforotioato con mejores rendimientos en comparaciïn con los obtenidos con los mïtodos anteriores. Mïs aïn, los presentes mïtodos son ïtiles para la sïntesis no sïlo de oligonucleïtidos de fosforotioato que tienen nïmeros relativamente grandes de unidades nucleotïdicas/nucleosïdicas en los mismos, por ejemplo de aproximadamente 6 a aproximadamente 50 y, lo que es mïs, particularmente de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 unidades nucleotïdicas/nucleosïdicas. Los mïtodos de la presente invenciïn emplean un sistema solvente muy simplificado, uno que es compatible con esquemas de reacciïn sintïticos automatizados y sintetizadores comerciales. El perfeccionamiento resultante en las oportunidades sintïticas permite una amplia aplicaciïn de los presentes 65 mïtodos en toda la quïmica de los ïcidos nucleicos.

Un aspecto de la presente invenciïn describe un mïtodo para la preparaciïn de oligonucleïtidos de fosforotioato, cuyo mïtodo consiste en: fosfitilar el 5’-hidroxilo de un resto de ïcido nucleico en acetonitrilo para formar un intermediario fosfito, estando unido dicho resto de ïcido nucleico a un soporte sïlido, y

oxidar dicho intermediario fosfito con un disulfuro de arilacetilo en una mezcla solvente de acetonitrilo: lutidina, o acetonitrilo:picolina en una razïn de volïmenes de 1, 5:1 a 1:1, 5 durante un tiempo suficiente para efectuar la conversiïn de dicho intermediario fosfito a dicho fosforotioato. Se pueden preparar oligonucleïtidos de fosforotioato que tienen una longitud y una secuencia predeterminadas repitiendo las etapas de fosfitilaciïn y oxidaciïn.

En otros aspectos de la presente invenciïn, se describen mïtodos para la sïntesis de anïlogos de oligonucleïtidos de fosforotioato, consistentes en la substituciïn con nucleïtidos, nucleïsidos, oligonucleïtidos y oligonucleïsidos modificados de nucleïtidos, nucleïsidos, oligonucleïtidos u oligonucleïsidos. Las modificaciones de nucleïtidos, nucleïsidos, oligonucleïtidos y oligonucleïsidos son bien conocidas en la tïcnica. Tal como se usa aquï, el tïrmino “oligonucleïtido de fosforotioato” pretende incluir anïlogos segïn se ha definido anteriormente.

El tïrmino “resto de fosfito”, tal como se usa aquï, pretende incluir restos de fosfito en nucleïsidos, nucleïtidos, oligonucleïsidos y oligonucleïtidos. En una realizaciïn preferida, los restos de fosfito estïn en un estado activado, tal como una dimetoxitritilfosforamidita. Los tïrminos “nucleïtido, nucleïsido, oligonucleïtido u oligonucleïsido”, tal como se utilizan aquï, pretenden incluir tanto especies naturales como especies no naturales o modificadas, como es sabido para los expertos en la tïcnica. Las modificaciones comunes incluyen modificaciones de los azïcares, tales como modificaciones 2’, y modificaciones de las bases o el uso de bases substitutas. Cuando se usa un oligonucleïtido o un oligonucleïtido modificado como resto de fosfito, tambiïn pueden estar presentes uniones modificadas, como es comïnmente sabido en la tïcnica.

Los presentes mïtodos tienen niveles inferiores demostrados de impurezas y mayores rendimientos en comparaciïn con cuando se usa DCE como solvente para la etapa de oxidaciïn. Los presentes mïtodos han mostrado tambiïn, de forma inesperada, que se pueden obtener rendimientos de aproximadamente el 99% en acetonitrilo/picolina. El acetonitrilo/picolina es totalmente compatible con la sïntesis automatizada sin gran modificaciïn de la rutina sintïtica, de tal forma que los presentes mïtodos pueden ser ventajosamente usados en un sintetizador automatizado. Por ejemplo, no se requieren grandes lavados, ya que se usa un solo solvente o mezcla que tiene un solvente comïn en todas las etapas sintïticas automatizadas. De este modo, se pueden eliminar las etapas de eliminaciïn del solvente y de lavado. Tambiïn... [Seguir leyendo]

1. Un mïtodo para la preparaciïn de oligonucleïtidos de fosforotioato, cuyo mïtodo consiste en: 5 fosfitilar el 5’-hidroxilo de un resto de ïcido nucleico en acetonitrilo para formar un intermediario fosfito, estando unido dicho resto de ïcido nucleico a un soporte sïlido, y

oxidar dicho intermediario fosfito con un disulfuro de acetilo en una mezcla solvente de acetonitrilo: lutidina, o acetonitrilo:picolina en una razïn de volïmenes de 1, 5:1 a 1:1, 5 durante un tiempo suficiente para efectuar la conversiïn de dicho intermediario fosfito a dicho fosforotioato.

2. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, que incluye la repeticiïn de dicha fosfitilaciïn y dicha oxidaciïn para obtener dicho oligonucleïtido de fosforotioato con una longitud predeterminada.

3. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, donde dicho intermediario fosfito es un dinucleïtido. 15

4. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, donde dicho intermediario fosfito es un oligonucleïtido.

5. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, donde dicha fosfitilaciïn es realizada usando un resto de

fosfito. 20

6. El mïtodo de la reivindicaciïn 5, donde dicho resto de fosfito es una fosforamidita.

7.El mïtodo de la reivindicaciïn 1, donde dicho disulfuro de arilacetilo es disulfuro de fenilacetilo. 25