Composiciones y utilizaciones dirigidas hacia la huntingtina.

Un oligonucleótido antisentido modificado químicamente con 17 a 35 nucleótidos que comprende al menos 17 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 118.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enfermedad de Huntington (EH) es un desorden neurodegenerativo causado por la mutación del gen de la huntingtina. La alteración de este único gen ampliamente expresado tiene como resultado un desorden progresivo y neurodegenerativo con un gran número de síntomas característicos. La enfermedad de Huntington es un desorden autosómico dominante que comienza en la mediana edad, aunque se han documentado casos de inicio desde la infancia hasta pasados los 70 años de edad. Una edad de inicio temprana se asocia con la herencia paterna, siendo el 70 % de los casos de enfermedad juvenil heredados del padre. Los síntomas tienen un componente emocional, motor y cognitivo. La corea es una característica específica del desorden motor y se define como los movimientos espontáneos excesivos irregulares en el tiempo, aleatorios y abruptos. Puede ser casi imperceptible o severa. Otras anomalías frecuentemente observadas incluyen distonía, rigidez, bradiquinesia, disfunción oculomotora y temblor. Los trastornos del movimiento voluntario incluyen descoordinación motora, disartria y disfagia. Los trastornos emocionales habituales incluyen depresión e irritabilidad, y el componente cognitivo incluye demencia subcortical (Mangiarini et al., 1996, Cell 87 : 493 – 506) . Los cambios en cerebros con EH son numerosos e incluyen pérdida neuronal y gliosis, particularmente en el córtex y en el cuerpo estriado (Vonsattel and DiFiglia. 1998. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 369 – 384) .

La mutación de la EH es una expansión de CAG que tiene como resultado la expansión de un tracto de la poliglutamina en la proteína de la huntingtina, una proteína 350 kDa de función desconocida (Huntington Disease Collaborative Research Group, 1993, Cell. 72: 971 – 83) . Se ha descubierto que el tamaño normal y expandido del alelo de la EH son repeticiones CAG6 – 37 y CAG35 – 121, respectivamente. Las secuencias más largas repetidas se asocian con un comienzo más temprano de la enfermedad. Se desconoce el mecanismo por el cual la expansión da lugar a la patología. Sin embargo, la ausencia de un fenotipo de EH borrado en individuos para una copia de huntingtina, o el aumento de la severidad de la enfermedad en estos homocigóticos para la expansión sugiere que la mutación no da lugar a una pérdida de funciones (Trottier et al., 1995, Nature Med., 10: 104 – 110) . Se han implicado la desregulación transcripcional y la pérdida de funciones de las proteínas coactivadoras transcripcionales en la patogénesis de la EH. Se ha demostrado específicamente que la huntingtina mutante afecta la transcripción dependiente del activador en los estados tempranos de la patogénesis de la EH (Dunah et al., 2002. Science 296: 2238 – 2243) . El perfil genético de la sangre humana identificó 322 ARNs mensajeros que mostraban una expresión significativamente alterada en muestras de sangre con EH en comparación a muestras de individuos normales o presintomáticos. La expresión de los genes marcadores estaba, de igual manera, sustancialmente alterada en las muestras de cerebro extraídas del caudado con EH post mórtem, lo que sugirió que el aumento de genes en las muestras de sangre refleja mecanismos de la enfermedad hallados en el cerebro. El control de la expresión de genes puede proporcionar un método sensible y cuantificativo de controlar la progresión de la enfermedad, especialmente en estadios tempranos de la enfermedad tanto en modelos animales como en pacientes humanos (Borovecki et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11023 – 11028) .

Se admitió la identificación del gen para el desarrollo de la enfermedad en modelos animales, incluyendo ratones transgénicos que portaban formas mutadas del gen humano o murino. Los modelos incluyen ratones con un fragmento del gen humano, normalmente el primer o los dos primeros exones, que contienen la expansión de glutamina, además del gen murino no alterado de tipo salvaje y endógeno; ratones con la huntingtina humana completa con una región de repetición expandida de glutamina, de nuevo con el gen endógeno murino; y ratones con repeticiones CAG patógeno insertadas en la región de repetición de CAG. Todos los modelos tienen, al menos, algunas características compartidas con la enfermedad humana. En estos ratones se probaron numerosos agentes terapéuticos diferentes para la prevención, la mejora y el tratamiento de la EH (véase, por ejemplo, Hersch y Ferrante, 2004. NeuroRx. 1:298 – 306) utilizando numerosos criterios. Se espera que los compuestos funcionen mediante diversos mecanismos diferentes que incluyen la inhibición de la transcripción, la inhibición de caspasas, la inhibición de histona deacetilasa, antioxidantes, la inhibición / antioxidante de la huntingtina, antioxidante / bioenergético, antiexcitotóxico y antiapoptótico.

Numerosos autores han informado de que la represión del transgén de la huntingtina mutante en modelos animales con EH reduce los síntomas asociados a la enfermedad, (véase, por ejemplo, Díaz – Hernández et al., (2005. J. Neurosci. 25: 9773 – 81) . Wang et al., (2005. Neurosci. Res. 53: 241 – 9) revelando que los ARNs pequeños de interferencia (siRNAs) dirigidos contra el gen de la huntingtina en el modelo murino R6 / 2 inhibió la expresión de huntingtina transgénica y prolongó significativamente la longevidad, mejorando la función motora y reduciendo la pérdida de peso corporal.

Machida et al., (2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 343: 190 – 7) informaron de que la liberación de ARN de interferencia (ARNi) mediada por virus adeno – asociado recombinante (rAAV) en el cuerpo estriado de un modelos murinos con EH mejoró las alteraciones neuropatológicas asociadas a la EH, como la acumulación de proteínas insolubles y la disminución de la expresión de DARPP – 32. Lo que es más importante, los autores declaran que los agregados neuronales en el cuerpo estriado se redujeron tras las transducción del ARNi en los animales en comparación a los del momento de la transducción del ARNi.

Harper et al., (2005. PNAS 102: 5820 – 25) encontraron que el ARNi dirigido a la huntingtina reducía el ARNm de la huntingtina y la expresión de proteínas en cultivos celulares y en un modelo murino con EH. Los autores declaran que el silenciamiento génico de la huntingtina mejoró las alteraciones neuropatológicas y de comportamiento asociadas a la EH.

Rodrigues – Lebron et al., , (2005. Mol. Ther. 12: 618 – 33) declararon que la transferencia genética de ARNi viral adeno – asociado recombinante serotipo 5 (rAAV5) para suprimir los niveles de huntingtina mutante estriada en el ratón transgénico R6 / 1 con EH tuvo como resultado niveles reducidos de ARNm de huntingtina y de proteínas. La reducción de la huntingtina fue concomitante a la reducción del tamaño y el número de inclusiones neuronales intranucleares y otros marcadores de la EH, y dio como resultado un comienzo retrasado del clasping en cola y extremidades en el fenotipo mostrado por los ratones R6 / 1.

Nguyen et al., (2005. PNAS, 102: 11840 – 45) utilizaron un compuesto de clioquinol de unión a metales para tratar las células PC12 que expresaban el gen de la huntingtina mutante y se halló una acumulación reducida de proteínas mutantes. El tratamiento con clioquinol en el ratón modelo R6 / 2 con EH dio como resultado fenotipos patológicos y de comportamiento mejorados, incluyendo la disminución de acumulación de agregados de huntingtina, disminución de atrofia estriada, mejora en la prueba del Rotarod, reducción de la pérdida de peso, normalización de los niveles de glucosa e insulina en sangre y prolongación de la esperanza de vida, apoyando la conclusión de que la reducción de proteínas de huntingtina mutante es terapéutica para la EH.

Haque et al., (Experimental Neurology, Vol. 144, 1997, págs 139 – 146) describen una terapia génica antisentido para enfermedades neurodegenerativas.

Nellemann et al., (Molecular and cellular neurosciences, Vol. 16, 2000, págs 313 – 323) revelan la inhibición de la síntesis de huntingtina por oligodesoxinucleótidos antisentido.

Boado et al., (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 294, 2000, págs 239 – 243) revelan la reducción mediada por antisentido del gen de la huntingtina humana.

En base a estos y otros estudios, cualquier experto en la disciplina reconocerá que reducir la expresión del gen mutante de la huntingtina será terapéutico para la EH.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención presenta un oligonucleótido antisentido químicamente modificado de 17 a 35 nucleótidos de longitud... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido antisentido modificado químicamente con 17 a 35 nucleótidos que comprende al menos 17 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 118.

2. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1 en el que dicho oligonucleótido es una molécula de ácido nucleico monocatenario.

3. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho oligonucleótido es 100 % complementario a la SEC ID Nº 4.

4. El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleósido modificado, un grupo azúcar modificado y /

o una nucleobase modificada.

5. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 4, en el que cada enlace internucleósido de dicho oligonucleótido es un enlace internucleósido de fosforotioato y / o en el que cada citosina del oligonucleótido antisentido es una 5 – metilcitosina.

6. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 4 o 5, en el que dicho oligonucleótido comprende al menos un resto de azúcar modificado que es un azúcar bicíclico o un azúcar que comprende 2´ -O – metoxietil.

7. El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 4 – 6, en el que dicho oligonucleótido comprende un segmento hueco que comprende 2´ -desoxinucleótidos colocados entre los segmentos de alas 5´ y 3´, en el que los segmentos de alas comprenden nucleótidos que tienen restos de azúcar modificado.

8. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 7, en el que el segmento hueco consiste en diez 2´ desoxinucleótidos y cada segmento laminar consiste en cinco nucleótidos modificados con 2´ -O – metoxietil.

9. El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 8 que tiene 20 nucleótidos.

10. El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 8, en el que dicho oligonucleótido antisentido comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 118.

11. El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 10, en el que el oligonucleótido antisentido es de 20 nucleótidos y comprende un oligonucleótido quimérico que tiene un segmento hueco colocado entre los segmentos laminares 5´ y 3´, en el que el segmento hueco consiste en diez 2´ desoxinucleótidos y cada segmento laminar consiste en cinco nucleótidos modificados con 2´ -O – metoxietil y en el que el oligonucleótido antisentido consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 118.

12. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 11, en el que cada enlace internucleósido de dicho oligonucleótido es un enlace internucleósido de fosforotioato y / o en el que cada citosina del olinucleótido antisentido es una 5 – metilcitosina.

13. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 12 o comprende una sal farmacéuticamente aceptable, éster, sal de dicho éster o profármaco del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

14. El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 12 o una composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su utilización en el tratamiento contra la enfermedad de Huntington.

15. El oligonucleótido antisentido o composición farmacéutica de la reivindicación 14 para su utilización en el tratamiento contra la enfermedad de Huntington en seres humanos mediante la administración en el sistema nervioso central (SNC) de un individuo, por ejemplo a través de la administración de un oligonucleótido antisentido directamente en el líquido cefalorraquídeo (CSF) .

16. La utilización de un oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 13 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra la enfermedad de Huntington.