Composiciones y sus usos dirigidos a la diacilglicerol aciltransferasa 1.

Un oligonucleótido antisentido dirigido a un ácido nucleico que codifica un polipéptido DGAT-1 para su uso en lamejora,

tratamiento o prevención de la fibrosis hepática

Composiciones y sus usos dirigidos a la diacilglicerol aciltransferasa 1

Listado de secuencias La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado DIBIS0088WOSEQ.txt, creado el 6 de agosto del 2007 con un tamaño de 72 Kb. La información en el formato electrónico del listado de secuencias se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Antecedentes de la invención La mala regulación de la diacilglicerol aciltransferasa 1 puede desempeñar un papel en el desarrollo de la obesidad. Después de la diferenciación de células 3T3-L1 de ratón en adipocitos maduros, se observan niveles de diacilglicerol aciltransferasa I aumentados 90 veces. Sin embargo, la sobre expresión forzada de la diacilglicerol aciltransferasa 1 en adipocitos maduros sólo produce un aumento de 2 veces en los niveles de diacilglicerol aciltransferasa 1. Esto conduce a un aumento en la síntesis de triglicéridos celular sin un aumento simultáneo en la lipólisis de triglicéridos, lo que sugiere que la manipulación del nivel de estado estacionario de la diacilglicerol aciltransferasa I puede ofrecer un medio posible para tratar la obesidad (Yu y col., J. Biol Chem., 277, 50876-50884 (2002) ) .

En una población turca aleatoria, se han identificado cinco polimorfismos en la secuencia no codificante 5’ y promotora de la diacilglicerol aciltransferasa 1 humana. Una variante común, la C79T, reveló actividad promotora reducida para el alelo 79T y está asociada con un índice de masa corporal más bajo, niveles de colesterol HDL mas altos en plasma y una tensión arterial diastólica más baja en mujeres turcas (Ludwig y col., Clin. Genet., 62, 68-73 (2002) ) .

Ratones knockout con el gen diacilglicerol aciltransferasa 1 desactivado presentan fenotipos de interés que indican la inhibición de la diacilglicerol aciltransferasa como un posible tratamiento para la obesidad y la resistencia a insulina asociada con la obesidad. Los ratones sin diacilglicerol aciltransferasa 1 son viables y aún pueden sintetizar triglicéridos a través de otras rutas biológicas. Aunque los ratones son magros y resistentes a obesidad inducida por la dieta (Smith y col., Nat. Genet., 25, 87-90 (2000) ) , han disminuido los niveles de triglicéridos tisulares y han aumentado la sensibilidad a la insulina y a la leptina (Chen y col., J. Clin. Invest., 109, 1049-1055 (2002) ) . Las estrategias con moléculas pequeñas para modular la síntesis de la diacilglicerol aciltransferasa I son ineficaces. (Tabata y col., Phytochemistr y , 46, 683-687 (1997) ; Tomoda y col., J. Antibiot. (Tokio) , 52, 689-694 (1999) ) .

La diacilglicerol transferasa 2 posee actividad de diacilglicerol transferasa que utiliza un amplia serie de sustratos de acil-CoA grasos de cadena larga (Cases y col., J. Biol. Chem., 276, 38870-38876 (2001) ; Lardizabal y col., J. Biol Chem., 276, 38862-38869 (2001) ) . La diacilglicerol transferasa 2 es un miembro de una familia de genes cuyas secuencias no están relacionadas con la diacilglicerol aciltransferasa 1. (Cases y col., J.Biol. Chem., 276, 3887038876 (2001) ) .

De manera preferente, el ARNm de la diacilglicerol transferasa 2 se regula por incremento mediante tratamiento con insulina, como se demuestra mediante ensayos in vitro que miden la actividad diacilglicerol de la fracción de membrana de adipocitos de ratón cultivados. En ratones en ayunas, la expresión de la diacilglicerol transferasa 2 se reduce enormemente, y tras volver a alimentar, aumenta drásticamente. Los modelos de expresión de dos enzimas que participan en la síntesis de ácidos grasos, la acetil-CoA carboxilasa y la ácido graso sintasa, responden al ayuno y a la realimentación de una manera similar. Estos resultados, junto con la observación de que la diacilglicerol transferasa 2 se expresa abundantemente en el hígado, sugieren que la diacilglicerol transferasa 2 está estrechamente relacionada con la ruta de la síntesis de ácidos grasos endógenos (Meegalla y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 298, 317-323 (2002) ) .

Estudios realizados con ratones que llevan una alteración en el gen de la diacilglicerol aciltransferasa 1 proporcionan pruebas de que la diacilglicerol aciltransferasa 2 contribuye a la síntesis de triglicéridos. Los niveles de expresión de ARNm de la diacilglicerol transferasa 2 son similares en segmentos intestinales tanto de ratones con déficit de diacilglicerol transferasa 1 como de tipo natural. Usando cloruro de magnesio para diferenciar entre la actividad diacilglicerol transferasa 1 y 2, Buhman y col. observaron que, en ratones con déficit de diacilglicerol transferasa 1, la actividad diacilglicerol transferasa se reducía al 50% en el intestino proximal y al 10-15% en el intestino distal (Buhman y col., J. Biol Chem., 277, 25474-25479 (2002) ) .

Adicionalmente, los niveles de ARNm de la diacilglicerol transferasa 2 no se regulan por incremento en el tejido hepático o adiposo de los ratones con déficit de diacilglicerol transferasa 1, incluso semanas después de una dieta rica en grasas. Sin embargo, en ratones ob/ob, que tienen una mutación en el gen de leptina que produce obesidad, la diacilglicerol transferasa 2 se expresa a niveles más altos que en los ratones de tipo natural, lo que sugiere que la diacilglicerol transferasa 2 puede ser parcialmente responsable de la masa grasa altamente acumulada observada en estos ratones. Adicionalmente, las mutaciones combinadas de la leptina y de la diacilglicerol transferasa 1 conducen a una elevación de tres veces en la expresión de la diacilglicerol transferasa 2 en tejido adiposo blanco, en comparación con los niveles, en los mismos tejidos, de ratones con déficit en diacilglicerol transferasa 1. Estos datos sugieren que la leptina normalmente regula negativamente la expresión de la diacilglicerol transferasa 2 y que la regulación positiva de la diacilglicerol transferasa 2 en tejido adiposo blanco en estos ratones puede proporcionar una ruta alternativa para la síntesis de triglicéridos que aún se produce en ratones con déficit en leptina/diacilglicerol transferasa 1 (Chen y col., J. Clin. Invest., 109, 1049-1055 (2002) ; Cases y col., J. Biol Chem., 276, 38870-38876 (2001) ; Chen y col., J. Clin. Invest., 109, 175-181 (2002) ) .

La fibrosis hepática es la acumulación excesiva de proteínas de la matriz extracelular que se produce en muchos tipos de enfermedades hepáticas crónicas. La fibrosis hepática avanzada da lugar a complicaciones tales como cirrosis, disfunción hepática e hipertensión portal; lo que requiere frecuentemente un trasplante de hígado. Las causas comunes de la fibrosis hepática incluyen infección crónica de hepatitis C, alcoholismo y esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) . La EHNA se caracteriza por presentar obesidad, diabetes mellitus de tipo 2, dislipidemia y, normalmente, resistencia a insulina. Los mecanismos celulares de la fibrosis hepática incluyen la liberación de factores solubles de células de Kupfer que activarán a las células estrelladas hepáticas (CEH) en mioblastos fibrogénicos. Las CEH activas también secretan citocinas para perpetuar el estado activo. Después de lesión persistente, las CEH activas producen grandes cantidades de proteínas de la matriz extracelular (PME) . La degradación de las PME se evita por la acción de citocinas tales como las TIMP. Actualmente, no hay ninguna terapia convencional para la fibrosis hepática. Como tal, el planteamiento que se recomienda seguir es eliminar el agente causante, el que para la EHNA incluiría, la pérdida de peso y tratamientos específicos para el síndrome metabólico. (Véase por ejemplo, Battler, R. y Brenner, D.A., J. Clin. Invest. 115:209-218 (2005) y apéndice; Elsharkawy, A.M., Oakley, F y Mann, D.A., Apoptosis v.10, n.4, 927-939 (2005) ; y Rockey, D.C. Clinincal Gastroenterology and Hepatology 3:95-107 (2005) ) . Chen y col., (Artherioscler. Thromb. Vasc. Biol., 25, 482-486 (2004) ) investigaron la fisiología de ratones con déficit de DGAT-1. Murr y y col (Diabetes, 52, A300 (2003) ) usaron inhibidores de DGAT-1 para modular niveles de glucosa en ratones. El documento WO 02/086085 describe anticuerpos que se unen a TIMP-1 para su uso en el tratamiento de diversas enfermedades. El documento US2004185559 describe moduladores de DGAT-1.

Existe una necesidad reconocida en la técnica para un tratamiento para la fibrosis hepática.

Sumario de la invención La invención proporciona un oligonucleótido antisentido dirigido a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de diacilglicerol aciltransferasa 1 (DGAT-1) para su uso en la mejora, tratamiento o prevención de la fibrosis hepática. Otros aspectos de la invención se exponen en... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido antisentido dirigido a un ácido nucleico que codifica un polipéptido DGAT-1 para su uso en la mejora, tratamiento o prevención de la fibrosis hepática

2. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1 dirigido a un ácido nucleico que tiene al menos una identidad del 80% con la SEC ID Nº 4 y que expresa la DGAT-1.

3. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que es un compuesto antisentido quimérico que comprende un intervalo de longitud de nucleósidos consecutivos en el que el extremo superior del intervalo es de 50 nucleósidos y en el que el extremo inferior del intervalo es de 12 nucleósidos, que comprende adicionalmente uno o más de

una modificación de nucleobase,

una modificación de enlace internucleosídico,

una modificación glucídica de alta afinidad seleccionada del grupo constituido por n 2’-O- (2-metoxietilo) , un 2’-Ometilo, un ácido nucleico bloqueado o un ácido nucleico con puentes de etileno o una combinación de las mismas, y que comprende adicionalmente no más de tres emparejamientos erróneos con la secuencia de ácido nucleico diana (SEC ID Nº 4) que codifica la DGAT-1.

4. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 3 en el que:

a. el extremo superior del intervalo es de 35 nucleósidos y el extremo inferior del intervalo es de 14 nucleósidos;

b. el extremo superior del intervalo es de 24 nucleósidos y el extremo inferior del intervalo es de 17 nucleósidos; o

c. el compuesto antisentido quimérico tiene una longitud de 20 nucleósidos consecutivos.

5. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 3 ó 4, en el que al menos un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato, o cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.

6. El oligonucleótido antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que la modificación de nucleobase es una 5-metil citosina.

7. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 3, en el que el compuesto antisentido tiene una longitud de 20 nucleósidos consecutivos, que comprende cinco modificaciones 2’-O- (2-metoxietilo) glucídicas consecutivas en el extremo 5’ del compuesto, seguidas por diez 2’desoxi glúcidos consecutivos que están seguidos por cinco modificaciones 2’-O- (2-metoxietilo) glucídicas consecutivas en el extremo 3’ del compuesto, que también comprende una modificación de enlace fosforotioato en cada enlace internucleosídico y una modificación 5-metil citosina en cada resto de citosina en el compuesto y que comprende no más de 3 emparejamientos erróneos con la secuencia de ácido nucleico que codifica la DGAT-1 diana.

8. El oligonucleótido antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que el compuesto antisentido no comprende ningún emparejamiento erróneo con la secuencia de ácido nucleico que codifica la DGAT-1 diana.

9. El oligonucleótido antisentido de cualquier reivindicación anterior, en el que la administración del oligonucleótido antisentido:

a. reduce la expresión de ARNm de colágeno;

b. reduce uno o más de un ARNm de a-SMA o un ARNm de TGF.beta.;

c. reduce los niveles de hidroxiprolina;

d. aumenta la esterificación de retinol; o

e. reduce la activación de las células estrelladas hepáticas.

10. El oligonucleótido antisentido de cualquier reivindicación anterior para su uso en la mejora, tratamiento o prevención de la fibrosis hepática, siendo dicho uso para prevenir, mejorar o tratar la deposición de colágeno en exceso en el hígado de un animal que necesita dicho tratamiento, poner en contacto al animal con el oligonucleótido antisentido.

11. El oligonucleótido antisentido de cualquier reivindicación anterior en un animal que necesita dicho tratamiento, teniendo el animal una afección que produce fibrosis hepática, seleccionándose la afección del grupo constituido por esteatosis hepática, EHNA, EHGNA, obesidad, diabetes mellitus, dislipidemia, resistencia a insulina, síndrome metabólico, colesterolemia o combinaciones de los mismos.

Figura 1

Datos bioquímicos

Figura 2 Figura 3 Figura 4

Expresión de ARNm de colágeno-1, aSMA y TGFb-1 en hígado de ratones db/db

Figura 5

Expresión de ARNm de DGAT1, 2 y TNFa en ratones db/db

Figura 6 Figura 7 Figura 8

Expresión de ARNm de colágeno, aSMA, TGFb-1 y TIMP-1 en hígado de ratones db/db

Figura 9