Composiciones y procedimientos para modular el corte y empalme de SMN2.

Un oligonucleótido antisentido dirigido al intrón 7 de una molécula de ácido nucleico que codifica SMN2,

en el quedicho oligonucleótido tiene una longitud de 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos y comprende una modificación 2'-Ometoxietilazúcaren cada posición, en el que el primer número de nucleótido (más en 5') al que el oligonucleótido seune es el nucleótido 122, 123, 124, 125, 126, 127 o 128 de la SEC ID Nº 1.

Composiciones y procedimientos para modular el corte y empalme de SMN2

Antecedentes de la invención Moléculas de ARNm eucarióticas recién sintetizadas, también conocidas como tránscritos primarios o pre-ARNm, fabricados en el núcleo, se procesan antes o durante el transporte al citoplasma para traducción. El procesamiento de los pre-ARNm incluye la adición de un capuchón metilado en 5' y una cola de poli (A) de 200-250 bases en el extremo 3' del tránscrito.

La siguiente etapa en el procesamiento del ARNm es el corte y empalme del pre-ARNm, que se produce en la maduración del 90-95 % de los ARNm de mamífero. Los intrones (o secuencias intermedias) son regiones de un tránscrito primario (o el ADN que lo codifica) que no están incluidos en la secuencia de codificación del ARNm maduro. Los exones son regiones de un tránscrito primario que permanecen en el ARNm maduro cuando alcanza el citoplasma. Los exones se cortan y empalman juntos para formar la secuencia del ARNm maduro. Las uniones de corte y empalme también se denominan sitios de corte y empalme y el lado 5’ de la unión a menudo se denomina el "sitio de corte y empalme en 5’” o “sitio donante de corte y empalme” y el lado 3’ de el "sitio de corte y empalme en 3’” o “sitio aceptor de corte y empalme” En el corte y empalme, el extremo 3’ del exón cadena arriba se une al extremo 5’ del exón cadena abajo. Por tanto, el ARN no sometido a corte y empalme (o pre-ARNm) tiene una unión exón/intrón en el extremo 5' de un intrón y una unión intrón/exón en el extremo 3' de un intrón. Una vez eliminado el intrón, los exones están contiguos en lo que en ocasiones se denomina la unión o límite exón/exón en el ARNm maduro. Los sitios de corte y empalme crípticos son aquéllos que se usan con menor frecuencia pero que se pueden usar cuando el sitio de corte y empalme habitual se bloquea o no está disponible. El corte y empalme alternativo, definido como el corte y empalme junto con diferentes combinaciones de exones, a menudo tiene como resultado múltiples tránscritos de ARNm de un solo gen.

Hasta el 50 % de las enfermedades genéticas humanas resultantes de una mutación puntual se debe a un corte y empalme aberrante. Dichas mutaciones puntuales pueden alterar un sitio de corte y empalme actual o crear un nuevo corte y empalme, lo que tiene como resultado tránscritos de ARNm compuestos por una combinación diferente de exones o con deleciones en los exones. Las mutaciones puntuales también pueden tener como resultado la activación de un sitio de corte y empalme críptico o alterar los elementos cis reguladores (es decir, potenciadores o silenciadores de corte y empalme) (Cartegni y col., Nat. Rev. Genet., 2002, 3, 285-298; Drawczak y col., Hum. Genet., 1992, 90, 41-54) .

Se han usado oligonucleótidos antisentido dirigidos mutaciones que conducen a corte y empalme aberrantes en varias enfermedades genéticas con el fin de redirigir el corte y empalme para dar un producto de corte y empalme deseado (Kole, Acta Biochimica Polonica, 1997, 44, 231-238) . Dichas enfermedades incluyen β-talasemia (Dominski y Kole, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 8673-8677; Sierakowska y col., Nucleosides & Nucleotides, 1997, 16, 1173-1182; Sierakowska y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 12840-44; Lacerra y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 9591-9596) ; distrofia de Kobe (Takeshima y col., J. Clin. Invest., 1995, 95, 515-520) ; distrofia muscular de Duchenne (Dunckley y col., Nucleosides & Nucleotides, 1997, 16, 1665-1668; Dunckley y col., Human Mol. Genetics, 1998, 5, 1083-90) ; osteogénesis imperfecta (Wang y Marini, J. Clin Invest., 1996, 97, 448-454) ; y fibrosis quística (Friedman y col., J. Biol. Chem., 1999, 274, 36193-36199) .

También se han usado compuestos antisentido para alterar la proporción de las formas largas y cortas de, pre-ARNm de Bcl-x (patente de EE.UU. 6, 172, 216; patente de EE.UU. 6, 214, 986; Taylor y col., Nat. Biotechnol. 1999, 17, 1097-1100) o para forzar sortear exones específicos que contienen codones de terminación prematuros (Wilton y col., Neuromuscul. Disord., 1999, 9, 330-338) . La patente de EE.UU. 5, 627, 274 y el documento WO 94/26887 divulgan composiciones y procedimientos para combatir el corte y empalme aberrantes en una molécula de pre-ARNm que contiene una mutación usando oligonucleótidos antisentido que no activan la RNAsa H.

La atrofia muscular espinal proximal (SMA) es un trastorno genético neurodegenerativo caracterizado por la pérdida de neuronas motoras espinales. La SMA es una enfermedad autosómica recesiva de inicio precoz y actualmente es la principal causa de muerte entre los lactantes. La gravedad de la SMA varía de un paciente a otro y, por tanto, se ha clasificado en tres tipos. La SMA de tipo I es la forma más grave con inicio en el nacimiento o en los primeros 6 meses y normalmente produce la muerte en un plazo de 2 años. Los niños con SMA de tipo I no pueden sentarse ni caminar. La SMA de tipo II es la forma intermedia y los pacientes se pueden sentar, pero no pueden estar de pie ni caminar. Los pacientes con SMA de tipo II, una forma crónica de la enfermedad, normalmente desarrollan SMA después de los 18 meses de edad (Lefebvre y col., Hum. Mol. Genet., 1998, 7, 1531-1536) .

La SMA se debe a la pérdida de ambas copias de la supervivencia de la neurona motora 1 (SMN1) , una proteína que forma parte de un complejo multiproteico que se piensa que está implicado en la biogénesis y reciclado de snRNP. Un gen casi idéntico, SMN2, existe en una región duplicada del cromosoma 5q13. Aunque SMN1 y SMN2 tienen el potencial de codificar la misma proteína, la SMN2 contiene una mutación traduccionalmente silente en la posición + 6 del exón 7, que tiene como resultado una inclusión ineficiente del exón 7 en los tránscritos de SMN2. Por tanto, la forma predominante de SMN2 es una versión truncada que carece del exón 7 y que es inestable e

inactiva (Cartegni y Krainer, Nat. Genet., 2002, 30, 377-384) .

Se han descrito moléculas de ácido nucleico peptídico quimérico diseñadas para modular el corte y empalme de SMN2 (documento WO 02/38738; Cartegni y Krainer, Nat. Struct. Biol., 2003, 10, 120-125) . Miyajima y col., (2002) , "Identification of a cis-acting element for the regulation of SMN exon 7 splicing", Journal of Biological Chemistr y , 277 (26) , páginas 23271-23277, divulga 2’-O-metil oligonucleótidos antisentido modificados contra el intrón 6 de SMN2. Dichos oligos tienen una longitud de 16 y 17 nucleótidos y uno de ellos aumentó la presencia del exón 7 en los tránscritos de SMN2. Singh y col., (2006) "Splicing of a critical exon of human Survival Motor Neuron is regulated by a unique silencer element located in the last intron.", Molecular and Cellular Biology, 26 (4) , páginas 1333-1346, " divulga secuencias antisentido específicas del intrón 7 de SMN2. El uso de esta molécula antisentido que tiene una modificación O-metilo en cada posición tiene como resultado un sorteo disminuido del exón 7. >

La tecnología antisentido es un medio eficaz para modular la expresión de uno o más productos génicos específicos, incluidos productos de corte y empalme alternativos, y es única en su utilidad en una serie de aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación. El principio detrás de la tecnología antisentido es que un compuesto antisentido, que hibrida con un ácido nucleico diana, modula las actividades de la expresión génica, tales como la transcripción, la traducción o el corte y empalme, a través de uno de una serie de mecanismos antisentido. La especificidad de secuencia de los compuestos antisentido los convierte en herramientas extremadamente atractivas para la validación de dianas y la funcionalización génica, así como agentes terapéuticos para modular de forma selectiva la expresión de genes implicados en la enfermedad.

En el presente documento se divulgan compuestos antisentido útiles para modular la expresión génica y vías asociadas mediante mecanismos antisentido, que pueden incluir mecanismos antisentido basados en la ocupación de la diana. En el presente documento se proporcionan compuestos antisentido dirigidos a SMN2 para uso en la modulación del corte y empalme de SMN2. Un experto en la técnica, una vez armado con la presente divulgación, podrá, sin experimentación indebida, identificar, preparar y explotar otros compuestos antisentido para estos usos.

Sumario de la invención La invención proporciona un oligonucleótido antisentido dirigido al intrón 7 de una molécula de ácido nucleico que codifica SMN2, en el que dicho oligonucleótido tiene una longitud de 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido antisentido dirigido al intrón 7 de una molécula de ácido nucleico que codifica SMN2, en el que dicho oligonucleótido tiene una longitud de 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos y comprende una modificación 2’-Ometoxietilazúcar en cada posición, en el que el primer número de nucleótido (más en 5’) al que el oligonucleótido se une es el nucleótido 122, 123, 124, 125, 126, 127 o 128 de la SEC ID Nº 1.

2. El oligonucleótido de la reivindicación 1 que tiene 15 nucleótidos de longitud.

3. El oligonucleótido de la reivindicación 1 que tiene 18 nucleótidos de longitud.

4. El oligonucleótido de la reivindicación 1 que tiene 20 nucleótidos de longitud.

5. El oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de nucleótidos de 10 dicho oligonucleótido comprende la SEC ID Nº 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87, 89 o 91.

6. El oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado.

7. El oligonucleótido de la reivindicación 6, que comprende al menos un enlace fosforotioato.

8. Un procedimiento para promover la inclusión del exón 7 en los tránscritos de SMN2 en una célula, tejido u órgano,

que comprende poner en contacto dicha célula, tejido u órgano in vitro con el oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en terapia.

10. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento de la atrofia muscular espinal.

11. Uso de un oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la preparación de un 20 medicamento para la atrofia muscular espinal.

12. Una composición farmacéutica, que comprende el oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.