Un compuesto antisentido corto de 10 a 16 monómeros de longitud ligados que comprende una región de huecode 2'-desoxirribonucleótidos flanqueada a cada lado por un extremo,

en el que cada extremo comprendeindependientemente 1 a 3 monómeros modificados de alta afinidad seleccionados de nucleótidos bicíclicos u otrosnucleótidos modificados en 2' y en el que el compuesto antisentido corto es elegido como diana para un ácidonucleico que codifica PCSK9.

Compuestos y procedimientos para modular la expresión de PCSK9

Antecedentes

La elección como diana de secuencias de genes causantes de enfermedad se sugirió por primera vez hace casi 40 años (Belikova y col., Tel. Leff., 1967, 37, 3557-3562) , Y la actividad antisentido se demostró en cultivo celular una década después (Zamecnik y col., Proc. Nal/. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 280-284) . Una ventaja de la tecnología antisentido en el tratamiento de una enfermedad o afección que procede de un gen causante de enfermedad es que es un enfoque genético directo que tiene la capacidad para modular la expresión de genes causantes de enfermedad específicos.

Generalmente, el principio detrás de la tecnología antisentido es que un compuesto antisentido se hibrida con un ácido nucleico diana y afecta la modulación de la actividad o función de la expresión génica, tal como transcripción, traducción o corte y empalme. La modulación de la expresión génica puede lograrse, por ejemplo, por degradación de diana o inhibición basada en la ocupación. Un ejemplo de la modulación de la función diana del ARN por degradación es la degradación basada en RNasa H del ARN diana tras la hibridación con un compuesto antisentido similar a ADN. Otro ejemplo de la modulación de la expresión génica por degradación diana es ARN interferente (ARNi) . El ARNi es una forma de silenciamiento de genes mediado por antisentido que implica la introducción de ARNbc que conduce a la reducción específica de secuencia de niveles de ARNm endógeno elegido como diana. La especificidad de secuencia hace que los compuestos antisentido sean extremadamente atractivos como herramientas para elegir como diana la validación y la funcionalización génica, además de herramientas de investigación para identificar y caracterizar nucleasas y como agentes terapéuticos para modular selectivamente la expresión de genes que participan en la patogénesis de una cualquiera de una variedad de enfermedades.

La tecnología antisentido es un medio eficaz para reducir la expresión de uno o más productos génicos específicos y, por tanto, ha demostrado ser excepcionalmente útil en varias aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación. Los nucleósidos químicamente modificados se usan rutinariamente para la incorporación en compuestos antisentido para potenciar una o más propiedades tales como resistencia a nucleasas, farmacocinética o afinidad por un ARN diana.

A pesar de la expansión del conocimiento desde el descubrimiento de la tecnología antisentido, queda sin satisfacer una necesidad de compuestos antisentido con mayor eficacia, toxicidad reducida y menor coste. Hasta la presente divulgación no se han empleado modificaciones de alta afinidad en el diseño de compuestos antisentido cortos para reducir ARN diana in vivo. Esto es debido a asuntos referentes al grado de especificidad diana que tendría una secuencia de 15 nucleótidos o más corta cuando se empleara para reducir la diana en un sistema vivo. Estudios previos han descrito que se logra mayor especificidad y, por tanto, mayores posibilidades de potencia, por compuestos antisentido de entre 16 y 20 nucleobases de longitud.

La presente divulgación describe que la incorporación de nucleótidos de alta afinidad químicamente modificados en compuestos antisentido permite que compuestos antisentido cortos de aproximadamente 8-16 nucleobases de longitud sean útiles en la reducción de ARN diana en animales con aumento de la potencia y mejora del índice terapéutico. Por tanto, en este documento se proporcionan compuestos antisentido cortos que comprenden modificaciones de nucleótidos de alta afinidad útiles para reducir un ARN diana in vivo. Tales compuestos antisentido cortos son eficaces a dosis inferiores a las de los compuestos antisentido previamente descritos, permitiendo una reducción en la toxicidad y el coste del tratamiento.

Graham y col. informan de que un compuesto antisentido puede inhibir proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9, que puede reducir LDL en suero en ratones hiperlipidémicos (Journal of Lipid Research, 2007, vol. 48, páginas 763-767) .

Resumen

La presente invención se refiere a un compuesto antisentido corto de 10 a 16 monómeros de longitud ligados que comprende una región de hueco de 2'-desoxirribonucleótidos flanqueada a cada lado por un extremo, en el que cada extremo comprende independientemente 1 a 3 monómeros modificados de alta afinidad seleccionados de nucleótidos bicíclicos u otros nucleótidos modificados en 2' y en el que el compuesto antisentido corto es elegido como diana para un ácido nucleico que codifica PCSK9.

En ciertas realizaciones, al menos uno de los monómeros modificados de alta afinidad es un nucleótido bicíclico con puentes de 4' a 2' y en ciertas de tales realizaciones cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos ligados independientemente seleccionados de -[ (C, ) (R2JJ]C-, -C (R, ) =C (R2) -, -C (R, ) =N-, -C (=NR, ) -, C (=O) -, -C (=S) -, -0-, -Si (R, ) 2-, -S (=O) , -y -N (R, ) -;

en las que

x es O, 1 ó 2;

n es 1, 2, 3 ó 4;

cada R1 Y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C L C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo e2-en alquinilo C-C12 sustituido, arilo C5-C20 , arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico

Cs-C" radical aliciclico Cs-C, sustituido, halógeno, OJ" NJ, J2, SJ" N3, COOJ" acilo (C (O) -H) , acilo sustituido, CN, sulfonilo (S (=O) , -J, ) o sulfoxilo (S (=O) -J, ) ; y

cada J1 Y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo e2-en alquenilo C2C12 sustituido, alquinilo e2-en alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C (=O) -H) , acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12

sustituido o un grupo protector, preferentemente cada uno de dichos puentes es, independientemente, 4'-CH 2-2', 4'- (CH2) 2-2', 4'-CH2-0-2', 4'- (CH2) 2-0-2', 4'-CH, ..0-N (R, ) -2' y 4'-CH2-N (R, ) -0-2'-en las que cada R, es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-Cn

En ciertas realizaciones, los otros nucleótidos modificados en 2' tienen sustituyentes seleccionados de halógeno, alilo, ami no, azido, tia, O-alilo, O-alquilo C, -C1Q, -OCF3, 0- (CH2J, -0-CH3, 2'-0 (CH2) , SCH3, 0- (CH2) , ..0-N (Rm) (Re) o

0-CH2-C (=0) -N (Rm) (Rc) en las que cada Rm y Re es, independientemente, H o alquilo C, -C1Q sustituido o sin sustituir. En tales realizaciones, preferentemente al menos uno de los nucleótidos modificados en 2' es un nucleótido 2'-OCH2CH20CH3.

En ciertas realizaciones, al menos un enlace monomérico es un enlace fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace monomérico es un enlace internucleosídico fosforotioato.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 12-16 monómeros de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen 10 a 14 monómeros de longitud.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen un motivo seleccionado de 1-12-1; 3-10-3; 2-10-3; 2-10-2; 1-10-1; 1-10-2; 1-9-2; 3-8-3; 2-8-2; 1-8-1; Y 3-6-3 en el que el primer número representa el número de monómeros en el extremo 5', el segundo número representa el número de monómeros en el hueco y el tercer

número representa el número de monómeros en el extremo 3'.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen un motivo seleccionado de 1-1-10-2, 1-1-8-2, 1-16-3 Y 1-2-8-2 en el que el primer número representa el número de monómeros en un primer extremo 5', el segundo número representa el número de monómeros en un segundo extremo 5', el tercer número representa el número de monómeros en el hueco y el cuarto número representa el número de monómeros en el extremo 3'.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen un motivo seleccionado de 2-10-1-1, 2-8-1-1, 3-61-1 Y 2-8-2-1 en el que el primer número representa el número de monómeros en el extremo 5', el segundo número representa el número de monómeros en el hueco, el tercer número representa el número de monómeros en un primer extremo... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto antisentido corto de 10 a 16 monómeros de longitud ligados que comprende una región de hueco de 2'-desoxirribonucleótidos flanqueada a cada lado por un extremo, en el que cada extremo comprende independientemente 1 a 3 monómeros modificados de alta afinidad seleccionados de nucleótidos bicíclicos u otros 5 nucleótidos modificados en 2' y en el que el compuesto antisentido corto es elegido como diana para un ácido nucleico que codifica PCSK9.

2. El compuesto antisentido corto de la reivindicación 1, en el que al menos uno de dichos monómeros modificados de alta afinidad es un nucleótido bicíclico con puentes de 4' a 2'.

3.El compuesto antisentido corto de la reivindicación 2, en el que cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos ligados independientemente seleccionados de -[(C1)(R2))]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- y -N(R1)-;

en las que

x es 0, 1 ó 2;

n es 1, 2, 3 ó 4;

cada R1 y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C" radical aliciclico C5-C, sustituido, halógeno, OJ" NJ, J2, SJ" N3, COOJ" acilo (C (O) -H) , acilo sustituido, CN, sulfonilo (S (=O) , -J, ) o sulfoxilo (S (=O) -J, ) ; y

cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C (=O) -H) , acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector

4. El compuesto antisentido corto de la reivindicación 3, en el que cada uno de dichos puentes es, independientemente,4'-CH2-2', 4'-(CH2)-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R1)-2' y 4'-CH2- N(R1)-O-2'- en las que cada R1 es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.

5. El compuesto antisentido corto de la reivindicación 1, en el que los otros nucleótidos modificados en 2' tienen sustituyentes seleccionados de halógeno, alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O- (CH2) 2-0-CH3. 2. O (CH2) , SCH3, O- (CH2) , -0-N (Rm) (R, ) o O-CH2-C (=O) -N (Rm) (R, ) en las que cada Rm YR, es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o sin sustituir.

6. El compuesto antisentido corto de la reivindicación 5, en el que al menos uno de los nucleótidos modificados en 2' es un nucleótid. 2. OCH2CH20CH3.

7. El compuesto antisentido corto de la reivindicación 1, en el que al menos un enlace monomérico es un enlace fosforotioato.

8. El compuesto antisentido corto de la reivindicación 1, en el que cada enlace monomérico es un enlace internucleosídico fosforotioato.

9. El compuesto antisentido corto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que tiene 12-16 monómeros de longitud.

10. El compuesto antisentido corto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que tiene 10 a 14 monómeros de longitud.

11. El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que tiene un motivo seleccionado de 1- 12-1; 3-10-3; 2-10-3; 2-10-2; 1-10-1; 1-10-2; 1-9-2; 3-8-3; 2-8-2; 1-8-1; y 3-6-3 en el que el primer número representa el número de monómeros en el extremo 5', el segundo número representa el número de monómeros en el hueco y el tercer número representa el número de monómeros en el extremo 3'.

12. El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que tiene un motivo seleccionado de 11-10-2, 1-1-8-2, 1-1-6-3 Y 1-2-8-2 en el que el primer número representa el número de monómeros en un primer extremo 5', el segundo número representa el número de monómeros en un segundo extremo 5', el tercer número representa el número de monómeros en el hueco y el cuarto número representa el número de monómeros en el extremo 3'.

13. El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que tiene un motivo seleccionado de 2- 10-1-1, 2-8-1-1, 3-6-1-1 y 2-8-2-1 en el que el primer número representa el número de monómeros en el extremo 5', el segundo número representa el número de monómeros en el hueco, el tercer número representa el número de monómeros en un primer extremo 3' y el cuarto número representa el número de monómeros en un segundo extremo 3'.

14. El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que tiene un motivo seleccionado de 1- 2-10-1-1; 1-1-8-1-1; 5 2-1-6-1-1; y 1-2-8-2-1 en el que el primer número representa el número de monómeros en un primer extremo 5', el segundo número representa el número de monómeros en un segundo extremo 5', el tercer número representa el número de monómeros en el hueco, el cuarto número representa el número de monómeros en un primer extremo 3' y el quinto número representa el número de monómeros en un segundo extremo 3'.

15. Un compuesto antisentido corto según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para su uso en la modulación de la expresión de PCSK9, en el que un ácido nucleico que codifica PCSK9 se pone en contacto con dicho compuesto antisentido.

16. Un compuesto antisentido corto de la reivindicación 15, en el que la modulación de la expresión de PCSK9 es en un individuo que tiene hipercolesterolemia, dislipidemia mixta, aterosclerosis, un riesgo de desarrollar aterosclerosis, enfermedad cardíaca coronaria, una historia de enfermedad cardíaca coronaria, enfermedad cardíaca coronaria de aparición temprana, uno o más factores de riesgo para enfermedad cardíaca coronaria, diabetes de tipo 11, diabetes de tipo II con dislipidemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, hiperacidemia grasa, esteatosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica o esteatosis hepática no alcohólica.

17. Un procedimiento in vitro de modulación de la expresión de PCSK9 poniendo en contacto un ácido nucleico que codifica PCSK9 con un compuesto antisentido corto según cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

18. Uso del compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para la preparación de un medicamento para reducir la expresión de ARN de PCSK9 en un animal.