Corte de proteínas de fusión mediante la utilización de la proteasa granzima B.

Método para la preparación de un polipéptido de interés en forma auténtica,

comprendiendo dicho métodolas etapas de:

(i) proporcionar una proteína de fusión que comprende, de extremo N-terminal a C-terminal, (a) una pareja de fusión,(b) un sitio de reconocimiento de proteasa granzima B que comprende un sitio de corte de proteasa granzima B, enel que el sitio de reconocimiento presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo queconsiste de ICPD ↓, ISAD ↓, ISSD ↓, ITPD ↓, VAPD ↓, VATD ↓, VCTD ↓, VDPD ↓, VDSD ↓, VGPD ↓, VRPD ↓, VTPD ↓,LEED ↓, LEID ↓, LGND ↓, LGPD ↓, AQPD ↓, y en el que:

↓ es el sitio de corte para dicha proteasa granzima B, o en el que el sitio de reconocimiento presenta la fórmulageneral:

en la que P4 es el aminoácido I o V P3 es el aminoácido E, Q o M P2 es X, en donde X se refiere a cualquieraminoácido, Pi es el aminoácido D, y ↓ es el sitio de corte para dicha proteasa granzima B, y (c) un polipéptido deinterés, en el que dicho sitio de corte es contiguo al polipéptido de interés, y

(ii) poner en contacto dicha proteína de fusión con la proteasa granzima B para cortarla en dicho sitio de corte,rindiendo dicho polipéptido de interés en forma auténtica.

Corte de proteínas de fusión mediante la utilización de la proteasa granzima B

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para la preparación de un polipéptido de interés en forma auténtica mediante el corte enzimático de proteínas de fusión producidas recombinantemente mediante la utilización de la proteasa granzima B. Además, la invención se refiere a proteínas de fusión que comprende un sitio de corte de granzima B.

Antecedentes de la invención y técnica anterior

La producción y purificación de polipéptidos recombinantes tales como proteínas farmacéuticas en una forma altamente purificada y bien caracterizada se ha convertido en una tarea importante dentro del área de la ingeniería de proteínas en general y de la industria farmacéutica en particular.

La preparación de dichos polipéptidos recombinantes se basa frecuentemente en técnicas que implican la producción de los polipéptidos en forma de proteínas de fusión o de proteínas híbridas, en las que una proteína o polipéptido de interés se fusiona con un portador o con una pareja de fusión, tal como un polipéptido o una proteína.

La presencia de una pareja de fusión o portador que se encuentra fusionado con el polipéptido de interés presenta las ventajas de que puede causar que la proteína de fusión sea más resistente a la degradación proteolítica, puede facilitar una expresión y secreción incrementadas, mejorar la solubilidad y permitir la posterior purificación por afinidad de la proteína de fusión. También mediante expresión de proteínas de fusión pueden producirse materiales potencialmente peligrosos biológicamente, tales como hormonas peptídicas, en una forma inactiva que posteriormente puede activarse in vitro mediante escisión de la pareja de fusión.

Sin embargo, dichas proteínas de fusión normalmente no resultan adecuadas por sí mismas como productos finales debido a que la pareja de fusión, por ejemplo, puede afectar a la actividad biológica o a la estabilidad del polipéptido de interés y, en el caso de que la proteína esté destinada al uso clínico, puede provocar problemas de antigenicidad. Por lo tanto, resulta necesario cortar la proteína de fusión para liberar el polipéptido de interés.

En principio lo anterior puede conseguirse mediante métodos químicos o bioquímicos tales como el corte enzimático. Sin embargo, resulta importante que el corte sea altamente específico y sólo tenga lugar en una secuencia de corte entre el polipéptido de interés y la pareja de fusión, es decir, la región de unión, y preferentemente no dentro del polipéptido de interés mismo, ya que ello podría, por ejemplo, afectar gravemente la actividad biológica del polipéptido de interés. Dichos métodos utilizan agentes que actúan mediante hidrólisis de los enlaces peptídicos y la especificidad del agente de corte está determinada por la identidad del residuo aminoácido en el enlace peptídico que se corta o en un sitio próximo al mismo.

Los métodos bioquímicos de corte de las proteínas de fusión se basan en la utilización de proteasas (enzimas proteolíticos) . Sin embargo, el corte enzimático de las proteínas de fusión se encuentra limitado en el aspecto de que el aminoácido o aminoácidos que son específicos del sitio de corte pueden hallarse también en el polipéptido de interés mismo. Por lo tanto, resultan particularmente adecuados los enzimas que, para cortar, no sólo reconocen un aminoácido sino una secuencia de aminoácidos, ya que la probabilidad de que una secuencia particular de aminoácidos se encuentre presente en una ocasión más en el polipéptido de interés además de en el sitio de corte entre el polipéptido de interés y la pareja de fusión es menor cuanto mayor sea el número de aminoácidos necesario para el reconocimiento y corte de la secuencia de corte.

Hasta hoy, se han utilizado varias proteasas para el corte enzimático de las proteínas de fusión mediante la puesta en contacto de la proteína de fusión con una proteasa bajo condiciones apropiadas.

El documento WO nº 03/010204 se refiere a un procedimiento para separar un polipéptido de interés de una proteína de fusión mediante la utilización de un enzima de corte ubiquitina, que según dicho documento es un enzima que corte un enlace peptídico situado contiguamente a la secuencia de aminoácidos RGG en el extremo C-terminal de proteínas tales como la ubiquitina.

La patente US nº 6.010.883 da a conocer un método en el que se utiliza el factor de coagulación sanguínea Xa (EC 3.4.21.6, una peptidasa de tipo serina formada a partir de factor proenzima X mediante proteolisis limitada) para la escisión de una pareja de fusión respecto de una proteína de fusión. Dicha proteasa corta específicamente después de la secuencia de aminoácidos X-Y-Gly-Arg, en la que X es Ile, Leu, Pro o Ala, e Y es Glu, Asp, Gln o Asn. El factor Xa preferentemente corta después de la secuencia de corte Ile-Glu-Gly-Arg.

Entre otros enzimas de la técnica anterior que se han propuesto y utilizado en métodos para el corte específico de proteínas de fusión se incluyen la proteinasa NIA del virus del grabado del tabaco, la colagenasa, la enteroquinasa, la subtilisina y la trombina.

Sin embargo, pueden producirse varios problemas al utilizar el corte proteolítico en los sistemas de proteínas de fusión. Un problema importante es que se produce el ataque proteolítico no específico de la proteína de fusión, lo que resulta en el corte en varios sitios y en consecuencia, en la pérdida de producto y en la generación de fragmentos contaminantes. Además, con los enzimas conocidos actualmente con frecuencia se producen problemas de corte ineficiente o incompleto de la proteína de fusión. Dicho corte ineficiente reduce el rendimiento y también puede introducir heterogeneidad en la proteína purificada, resultando en la recuperación de sólo una fracción reducida de la proteína deseada.

Un problema adicional que se asocia con varios de los enzimas utilizados actualmente para el corte de proteínas de fusión es que con frecuencia se unen aminoácidos espurios o extraños al producto polipéptido cortado (el polipéptido de interés) . Estos aminoácidos típicamente se encuentran presentes al cortar un conector, y los residuos aminoácidos no relacionados pueden presentar un efecto sobre las propiedades del polipéptido de interés resultante. Lo anterior puede resultar crucial para proteínas producidas para terapéutica humana. Por lo tanto, es altamente deseable porder producir polipéptidos auténticos puros libres de secuencias cortas o residuos de aminoácidos extraños.

El problema de que queden aminoácidos extraños en el polipéptido de interés tras el corte queda ilustrado en la patente US nº 4.543.329, que describe un procedimiento para cortar selectivamente una proteína de fusión mediante la utilización de colagenasa. Sin embargo, la utilización de dicho enzima produce un polipéptido de interés con la secuencia extraña de aminoácidos Gly-Pro en su extremo N-terminal. Con el fin de obtener el polipéptido de interés en forma auténtica, estos aminoácidos extraños (Gly y Pro) deben eliminarse posteriormente en una etapa de reacción posterior mediante la utilización de una o más aminopeptidasas diferentes (tales como la aminoacilprolina aminopeptidasa y la prolina aminopeptidasa) .

El problema también queda ilustrado en la patente US nº 5.427.927, que describe un procedimiento para el corte específico de secuencia de proteínas de fusión mediante la utilización de IgA proteasa, en la que se inserta un sitio de IgA proteasa en la región de unión de una proteína de fusión que es cortado posteriormente con IgA proteasa. El sitio de reconocimiento para la IgA proteasa es la secuencia de aminoácidos Y-ProLX-Pro, en la que X puede ser cualquier aminoácido, Y puede ser uno o varios aminoácidos arbitrarios, y L se refiere al sitio de corte. Sin embargo, las proteínas de interés que se forman tras el corte con la IgA proteasa se caracterizan porque presentan una secuencia extraña de aminoácidos X-Pro en su extremo N-terminal, es decir, el polipéptido de interés resultante no se encuentra en su forma nativa o auténtica.

En la actualidad, los enzimas proteolíticos más ampliamente utilizados para el corte de proteínas de fusión son las serina proteasas factor Xa y trombina. Sin embargo, es conocido que ambos enzimas llevan a cabo un corte no específico de las proteínas de fusión. Además, el factor Xa ha sido aislado a partir de suero bovino y, en consecuencia, al utilizarlo para cortar proteínas para aplicaciones terapéuticas ha requerido una purificación y análisis extensivos posteriormente... [Seguir leyendo]

1. Método para la preparación de un polipéptido de interés en forma auténtica, comprendiendo dicho método las etapas de:

(i) proporcionar una proteína de fusión que comprende, de extremo N-terminal a C-terminal, (a) una pareja de fusión,

(b) un sitio de reconocimiento de proteasa granzima B que comprende un sitio de corte de proteasa granzima B, en el que el sitio de reconocimiento presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de ICPDL, ISADL, ISSDL, ITPDL, VAPDL, VATDL, VCTDL, VDPDL, VDSDL, VGPDL, VRPDL, VTPDL, LEEDL, LEIDL, LGNDL, LGPDL, AQPDL, y en el que: L es el sitio de corte para dicha proteasa granzima B, o en el que el sitio de reconocimiento presenta la fórmula general:

en la que P4 es el aminoácido I o V P3 es el aminoácido E, Q o M P2 es X, en donde X se refiere a cualquier aminoácido, Pi es el aminoácido D, y L es el sitio de corte para dicha proteasa granzima B, y (c) un polipéptido de interés, en el que dicho sitio de corte es contiguo al polipéptido de interés, y

(ii) poner en contacto dicha proteína de fusión con la proteasa granzima B para cortarla en dicho sitio de corte, rindiendo dicho polipéptido de interés en forma auténtica.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la formula general comprende además los aminoácidos P1' y P2', resultando en la fórmula general: P4 P3 P2 P1LP1'P2', en la que P1' es X, en donde X se refiere a cualquier aminoácido, P2' es G y en donde P1' y P2' son una parte del polipéptido de interés.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la formula general comprende además los aminoácidos P1', P2', P3' y P4', resultando en la fórmula general P4 P3 P2 P1LP1'P2'P3'P4', en la que P4' es D o E, y en la que P1', P2', P3' y P4' son una parte del polipéptido de interés.

4. Método según la reivindicación 1, en el que el polipéptido de interés se selecciona de entre el grupo que consiste de un enzima, una hormona polipeptídica, un fragmento de región variable de anticuerpo de cadena sencilla y apolipoproteína A.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la hormona polipeptídica se selecciona de entre el grupo que consiste de somatotropina, glucagón, insulina e interferón.

6. Método según la reivindicación 4, en el que dicho enzima es granzima B.

7. Método según la reivindicación 1, en el que la pareja de fusión es una etiqueta de afinidad.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la etiqueta de afinidad se selecciona de entre el grupo que consiste de una etiqueta polihistidina, una etiqueta poliarginina, una etiqueta FLAG, una etiqueta Strep, una etiqueta c-myc, una etiqueta S, un péptido de unión a calmodulina, un péptido de unión a celulosa, un dominio de unión a quitina, una etiqueta glutatión-S-transferasa o una proteína de unión a maltosa.

9. Método según la reivindicación 1, en el que la proteasa granzima B se selecciona de entre el grupo que consiste de la proteasa granzima B humana, la proteasa granzima B de ratón y la proteasa granzima B de rata.

10. Método según la reivindicación 1, en el que dicha proteasa granzima B se encuentra en una forma inmovilizada.

11. Método según la reivindicación 10, en el que dicha proteasa granzima B se encuentra mediante el extremo C-terminal.

12. Método según la reivindicación 10, en el que la proteasa granzima B se encuentra inmovilizada mediante un residuo aminoácido lisina.

13. Método según la reivindicación 8, en el que la etiqueta de afinidad es una etiqueta polihistidina, y en el que la proteína de fusión se pone en contacto con proteasa granzima B en presencia de iones Ni2+ y de ácido nitrilotriacético (NTA) .

14. Método según la reivindicación 13, en el que la concentración de Ni2+ se encuentra comprendida en el intervalo de entre 1 y 20 mM y la concentración de NTA se encuentra comprendida en el intervalo de entre 1 y 20

mM.

15. Proteína de fusión que comprende, de extremo N-terminal a C-terminal, (a) una pareja de fusión, (b) un sitio de reconocimiento de proteasa granzima B que comprende un sitio de corte, en el que el sitio de reconocimiento presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de ICPDL, ISADL, ISSDL, ITPDL, VAPDL, VATDL, VCTDL, VDPDL, VDSDL, VGPDL, VRPDL, VTPDL, LEEDL, LEIDL, LGNDL, LGPDL, AQPDL, y en el que L es el sitio de corte para dicha proteasa granzima B, o en el que el sitio de reconocimiento presenta la fórmula general:

en la que: P4 es el aminoácido I o V, P3 es el aminoácido E, Q o M, P2 es X, en donde X se refiere a cualquier aminoácido, P1 es el aminoácido D, y

L es el sitio de corte para dicha proteasa granzima B, y (c) un polipéptido de interés, en el que dicho sitio de corte es contiguo al polipéptido de interés.

16. Proteína de fusión según la reivindicación 15, en la que la formula general comprende además los aminoácidos P1' y P2', resultando en la fórmula general P4 P3 P2 P1LP1'P2', en la que P1' es X, en donde X se refiere a cualquier aminoácido, P2' es G, y en la que P1' y P2' son una parte del polipéptido de interés.

17. Proteína de fusión según la reivindicación 15, en la que la formula general comprende además los aminoácidos P1', P2', P3' y P4', resultando en la fórmula general P4 P3 P2 P1LP1'P2'P3'P4', en la que P4' es D o E, y en la que P1', P2', P3' y P4' son una parte del polipéptido de interés.

18. Proteína de fusión según la reivindicación 15, en la que el polipéptido de interés se selecciona de entre el grupo que consiste de un enzima, una hormona polipeptídica, un fragmento de región variable de anticuerpo de cadena sencilla y apolipoproteína A.

19. Proteína de fusión según la reivindicación 18, en la que la hormona polipeptídica se selecciona de entre el grupo que consiste de somatotropina, glucagón, insulina e interferón.

20. Proteína de fusión según la reivindicación 18, en la que dicho enzima es granzima B.

21. Proteína de fusión según la reivindicación 20, en la que dicho granzima B comprende una etiqueta polihistidina C-terminal.

22. Proteína de fusión según la reivindicación 20, seleccionada de entre el grupo que consiste de pro-IEPDGrB-H6 (SEC ID nº 2) y pro-IEAD-GrB-H6 (SEC ID nº 3) .

23. Proteína de fusión según la reivindicación 20, seleccionada de entre el grupo que consiste de pro-IEPDGrB-H6 C228A (SEC ID nº 5) , pro-IEPD-GrB-H6 C228T (SEC ID nº 6) , pro-IEPD-GrB-H6 C228V (SEC ID nº 7) y pro-IEPD-GrB-H6 C228F (SEC ID nº 8) .

24. Proteína de fusión según la reivindicación 15, en la que la pareja de fusión es una etiqueta de afinidad.

25. Proteína de fusión según la reivindicación 24, en el que la etiqueta de afinidad se selecciona de entre el grupo que consiste de una etiqueta polihistidina, una etiqueta poliarginina, una etiqueta FLAG, una etiqueta Strep, una etiqueta c-myc, una etiqueta S, un péptido de unión a calmodulina, un péptido de unión a celulosa, un dominio de unión a quitina, una etiqueta glutatión-S-transferasa y una proteína de unión a maltosa.

26. Secuencia de ácidos nucleicos aislada codificante de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25.

27. Vector recombinante que comprende la secuencia de ácidos nucleicos aislada según la reivindicación 26.

28. Célula huésped transformada con un vector según la reivindicación 27.

29. Método para la producción de una proteína de fusión según la reivindicación 15, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar un vector recombinante que comprende la secuencia de ácidos nucleicos aislada según la reivindicación 26 ligada operablemente a un promotor,

(ii) transformar una célula huésped con dicho vector recombinante,

(iii) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones que permitan expresar dicha proteína de fusión, y

(iv) opcionalmente aislar dicha proteína de fusión.