Copolímeros sensibles a la temperatura y usos de los mismos.
Un copolímero sensible a la temperatura para formar un recubrimiento de película sobre la superficie de unsustrato de cultivo celular,
comprendiendo el copolímero unidades monoméricas hidrófilas sensibles a latemperatura, unidades monoméricas hidrófobas y/o hidrófilas no sensibles a la temperatura y medios de reticulaciónpara unir covalentemente el copolímero a la superficie del sustrato.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2010/050789.
Solicitante: THE UNIVERSITY OF MANCHESTER.
Nacionalidad solicitante: Reino Unido.
Dirección: OXFORD ROAD MANCHESTER M13 9PL REINO UNIDO.
Inventor/es: LU, JIAN, YANG,Lei.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C08F220/26 QUIMICA; METALURGIA. › C08 COMPUESTOS MACROMOLECULARES ORGANICOS; SU PREPARACION O PRODUCCION QUIMICA; COMPOSICIONES BASADAS EN COMPUESTOS MACROMOLECULARES. › C08F COMPUESTOS MACROMOLECULARES OBTENIDOS POR REACCIONES QUE IMPLICAN UNICAMENTE ENLACES INSATURADOS CARBONO - CARBONO (producción de mezclas de hidrocarburos líquidos a partir de hidrocarburos de número reducido de átomos de carbono, p. ej. por oligomerización, C10G 50/00; Procesos de fermentación o procesos que utilizan enzimas para la síntesis de un compuesto químico dado o de una composición dada, o para la separación de isómeros ópticos a partir de una mezcla racémica C12P; polimerización por injerto de monómeros, que contienen uniones insaturadas carbono-carbono, sobre fibras, hilos, hilados, tejidos o artículos fibrosos hechos de estas materias D06M 14/00). › C08F 220/00 Copolímeros de compuestos que tienen uno o más radicales alifáticos insaturados, teniendo solamente cada uno un enlace doble carbono-carbono, y estando solamente terminado por un radical carboxi o una sal, anhídrido, éster, amida, imida o nitrilo del mismo. › Esteres que contienen oxígeno en adición al oxígeno del carboxi.
- C08F220/56 C08F 220/00 […] › Acrilamida; Metacrilamida.
- C09D133/26 C […] › C09 COLORANTES; PINTURAS; PULIMENTOS; RESINAS NATURALES; ADHESIVOS; COMPOSICIONES NO PREVISTAS EN OTRO LUGAR; APLICACIONES DE LOS MATERIALES NO PREVISTAS EN OTRO LUGAR. › C09D COMPOSICIONES DE REVESTIMIENTO, p. ej. PINTURAS, BARNICES, LACAS; EMPLASTES; PRODUCTOS QUIMICOS PARA LEVANTAR LA PINTURA O LA TINTA; TINTAS; CORRECTORES LIQUIDOS; COLORANTES PARA MADERA; PRODUCTOS SOLIDOS O PASTOSOS PARA ILUMINACION O IMPRESION; EMPLEO DE MATERIALES PARA ESTE EFECTO (cosméticos A61K; procedimientos para aplicar líquidos u otros materiales fluidos a las superficies, en general B05D; coloración de madera B27K 5/02; vidriados o esmaltes vitreos C03C; resinas naturales, pulimento francés, aceites secantes, secantes, trementina, per se , C09F; composiciones de productos para pulir distintos del pulimento francés, cera para esquíes C09G; adhesivos o empleo de materiales como adhesivos C09J; materiales para sellar o guarnecer juntas o cubiertas C09K 3/10; materiales para detener las fugas C09K 3/12; procedimientos para la preparación electrolítica o electroforética de revestimientos C25D). › C09D 133/00 Composiciones de revestimiento a base de homopolímeros o copolímeros de compuestos con uno o varios radicales alifáticos insaturados, con un solo enlace doble carbono-carbono y uno al menos terminado por un solo radical carboxilo, o sus sales, anhídridos, ésteres, amidas, imidas o nitrilos; Composiciones de revestimiento a base de derivados de tales polímeros. › Homopolímeros o copolímeros de acrilamida o metacrilamida.
- C09D143/04 C09D […] › C09D 143/00 Composiciones de revestimiento a base de homopolímeros o copolímeros de compuestos con uno o varios radicales alifáticos insaturados, con un solo enlace doble carbono-carbono y que contienen boro, silicio, fósforo, selenio, teluro o un metal; Composiciones de revestimiento a base de derivados de tales polímeros. › Homopolímeros o copolímeros de monómeros que contienen silicio.
- C12N1/02 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Separación de microorganismos de sus medios de cultivo.
- C12N11/08 C12N […] › C12N 11/00 Enzimas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Células microbianas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Su preparación. › siendo el soporte un polímero sintético.
- C12N5/00 C12N […] › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
PDF original: ES-2439281_T3.pdf
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Fragmento de la descripción:
Copolímeros sensibles a la temperatura y usos de los mismos Esta invención se refiere a copolímeros sensibles a la temperatura, a películas poliméricas formadas a partir de estos copolímeros y a aplicaciones particulares de estas películas poliméricas, particularmente en el campo del cultivo celular. Más específicamente, la presente invención se refiere al uso de estas películas poliméricas en el campo del cultivo celular para proporcionar un medio para controlar la adhesión celular a, y la separación de, la superficie de un sustrato de soporte de cultivo celular.
Antecedentes La capacidad para cultivar células eucariotas y procariotas en un cultivo in vitro se utiliza en un amplio intervalo de aplicaciones comerciales y/o de investigación.
Ciertos tipos de células pueden cultivarse en cultivos en suspensión, donde las células se dispersan eficazmente o se hacen "flotar" dentro de un medio de crecimiento adecuado, mientras que otros tipos de células, incluyendo muchas células de mamífero, solo se desarrollarán y proliferarán en un medio de cultivo una vez que se han adherido a la superficie de sustratos de soporte adecuados (tales como, por ejemplo, una de las superficies internas de un matraz o placa de cultivo celular) .
Para mantener la viabilidad a largo plazo de las células cultivadas en un cultivo y evitar la senescencia asociada con una alta densidad celular dentro de un medio de cultivo, es necesario hacer pasar (o "dividir") las células en una base regular. Este proceso implica cultivar un pequeño número de células desde el medio de cultivo maduro y sembrarlas en un medio de cultivo fresco en el que pueden continuar desarrollándose y permanecer viables. También es necesario poder recoger las células de un medio de cultivo de manera que puedan usarse para una aplicación particular. En el caso de cultivos de suspensión, las células pueden recogerse simplemente retirando parte o todo el medio de cultivo de suspensión maduro. Sin embargo, en el caso de células que crecen sobre la superficie de un sustrato de soporte, tal como una superficie interna de una placa o matraz de cultivo celular, las células se adherirán a la superficie de soporte y necesitarán ser separadas, ya sea por agitación mecánica (por ejemplo, raspado o lavado vigoroso y repetido de la superficie de soporte con un fluido) y/o usando enzimas (por ejemplo, tripsina) para digerir los componentes de la matriz extracelular que unen las células a la superficie de soporte. Un problema asociado con estas técnicas enzimáticas y/o mecánicas es que no solo destruyen de forma invasiva las proteínas de unión de célula a célula conduciendo a la liberación celular, sino que también dañan irreversiblemente las proteínas asociadas con la membrana celular dando como resultado la pérdida de parte de la función celular (Yamato et al., J. Biomed. Mater. Res., 1999, 44: 44-52; Shimizu et al., Biomaterials, 2003, 24: 23092316; Canavan et al., J Biomed Mater Res, 2005, 75A: 1-13) .
Por consiguiente, hay una necesidad de enfoques alternativos y mejorados para separar las células de la superficie de un sustrato de soporte.
Un enfoque alternativo implica el uso de un polímero sensible a la temperatura, tal como poli (N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm) para la recogida de células (Yamada et al., Makromol. Chem. Rapid Commun., 1990, 11: 571-576) . La PNIPAAm y sus derivados presentan una menor temperatura en solución crítica (LCST) en solución acuosa (Kwon et al., Biomaterials, 2003, 24: 1223-1232) . Entre la LCST, el polímero muestra cambios notables en hidratación como respuesta a pequeñas variaciones de temperatura. Las cadenas de PNIPAAm se hidratan para formar una estructura expandida por debajo de la LCST, mientras que por encima de la LCST, las cadenas poliméricas se hidratan y se condensan estructuralmente. Este comportamiento sensible a la temperatura es reversible y está asociado con la formación y destrucción de enlaces de hidrógeno entre las moléculas de agua y las uniones de amida. Además de su uso en el campo del cultivo celular, la PNIPAAm sensible a la temperatura se ha estudiado para un número de aplicaciones diferentes, incluyendo administración de fármacos y la inmovilización y separación de proteínas.
En el cultivo celular, una película fina de PNIPAAm normalmente se injerta o recubre sobre las placas de cultivo o membranas comerciales. Las células en su mayor parte se cultivan a aproximadamente 37 ºC in vitro. A esta temperatura, la película de polímero se deshidrata y su superficie es principalmente hidrófoba y muy adecuada para fijación y crecimiento celular. Tras alcanzar la confluencia, la temperatura se reduce a por debajo de 30 ºC y la película fina se hidrata. Tras la hidratación, el volumen de la película se expande y su superficie se hace hidrófila. La combinación de expansión de la película de polímero y su naturaleza hidrófila fuerzan a las células a separarse del sustrato. El uso de un polímero sensible a la temperatura de PNIPAAm para retirar las células adheridas posee un número de ventajas respecto a las técnicas de digestión enzimática o disociación mecánica usadas más habitualmente. En particular, a medida que las células crecen sobre sustratos recubiertos con PNIPAAm se recuperan con solo una caída en la temperatura y las membranas celulares de las células permanecen intactas. En consecuencia, las células mantienen mejor las actividades de crecimiento y función biológica en comparación con aquellas cultivadas usando enzimas o raspadores de células (Canavan et al., J Biomed Mater Res, 2005, 75A: 1-13) .
Sin embargo, a pesar de los beneficios ofrecidos por la PNIPAAm sensible a la temperatura para el cultivo celular, su uso comercialmente ha permanecido limitado. Esto se debe principalmente a que la mayoría de películas de PNIPAAm se han fijado sobre placas de cultivo o membranas que se generan mediante procedimientos de tratamiento elaborados y caros tales como irradiación por haz de electrones (Yamada et al., Makromol. Chem. Rapid Commun, 1990, 11: 571-576; Kwon et al., Biomaterials, 2003, 24: 1223-1232; Yamato et al., J Biomed Mater Res, 1999, 44: 44-52; Shimizu et al., Biomaterials, 2003, 24: 2309-2316) , tratamiento con plasma (Akiyama et al., Langmuir, 2004, 20: 5506-5511; Schmaljohann et al., Biomacromolecules, 2003, 4: 1733-1739; Nitschke et al., Express Polymer Letters, 2007, I: 660-666) , irradiación por UV (Chen et al., Materials Science and Engineering, 2005, 25: 472-478; Matsuda et al., Biomacromolecules 2007, 8: 2345-2349) y enfoques químicos exigentes (Cho et al., Biomaterials, 2004, 25: 5743-5751; Ista et al., Langmuir, 2001, 17: 2552-2555) . En cada una de estas reacciones, las superficies se activan y los monómeros se añaden a la solución. La polimerización ocurre y las cadenas de polímero injertadas a la superficie se forman a partir de monómeros injertados directamente sobre la superficie del sustrato. El proceso de polimerización directa de la película sensible a la temperatura sobre la superficie del sustrato es laborioso, consume tiempo y es caro, puesto que a menudo implica una instrumentación y un entorno de laboratorio caros. Por consiguiente, esto ha evitado la aplicación extensa de esta técnica.
Se han descrito también procesos para la polimerización por radicales con transferencia de átomos iniciada en superficie por secuencia viva (SI-ATRP) para crear un copolímero de bloques injertado a la superficie tal como PNIPAAm-PS para fijación y separación celular (Wu et al., Langmuir 2009, 25, 2900-2906 y Yu et al., Langmuir 2010, DOI: 10.1021/la904663m) . Sin embargo, es necesario injertar la superficie de óxido de silicio del sustrato con un 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) subyacente, seguido del injerto químico del iniciador de superficie tal como bromuro de bromoisobutirilo (BIBB) o cloruro de cloroacetilo. Como con otros enfoques de polimerización, este método requiere también formación de una película superficial in situ sobre la superficie del sustrato. Adicionalmente, como están implicadas muchas etapas, es difícil controlar el crecimiento de la película de superficie, provocando incertidumbre al predecir el espesor y composición de la capa. Tales procesos serán difíciles a gran escala.
La presente invención pretende abordar estos inconvenientes proporcionando un recubrimiento de película polimérica para los sustratos de soporte del cultivo celular que es simple de preparar, barato y fiable.
Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un medio sencillo, barato y fiable para proporcionar un recubrimiento de película polimérica sensible a la temperatura sobre el sustrato de soporte del cultivo celular, que proporciona una superficie sobre la cual... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un copolímero sensible a la temperatura para formar un recubrimiento de película sobre la superficie de un sustrato de cultivo celular, comprendiendo el copolímero unidades monoméricas hidrófilas sensibles a la temperatura, unidades monoméricas hidrófobas y/o hidrófilas no sensibles a la temperatura y medios de reticulación para unir covalentemente el copolímero a la superficie del sustrato.
2. Un copolímero de acuerdo con la reivindicación 1, donde las unidades monoméricas son monómeros metacrílicos,
acrílicos y/o de bisacrilamida sustituidos. 10
3. Un copolímero de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde los monómeros sensibles a la temperatura se seleccionan entre N-alquil acrilamidas sustituidas y N-alquil metacrilamidas sustituidas, N, N-di-alquil acrilamida sustituida y N, N-di-alquil metacrilamida sustituida o mezclas de las mismas.
4. Un copolímero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el monómero sensible a la temperatura se selecciona entre N-isopropilacrilamida y N-isopropilmetacrilamida o una mezcla de las mismas.
5. Un copolímero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los monómeros hidrófobos y/o hidrófilos son monómeros de acrilato N-sustituido o metacrilato N-sustituido. 20
6. Un copolímero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el medio de reticulación es un grupo funcional reactivo presente como parte de las unidades monoméricas sensibles a la temperatura o hidrófilas/hidrófobas o el medio de reticulación es un constituyente monomérico adicional del copolímero que tiene un grupo funcional que reacciona con los grupos funcionales presentes sobre la superficie del sustrato.
7. Un copolímero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el medio de reticulación es un grupo de reticulación de silano seleccionado entre un grupo metoxisilano y/o un grupo etoxisiliano.
8. Un copolímero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el copolímero es poli (N
isopropilacrilamida-co-hidroxipropil metacrilato-co-3-trimetoxisilipropil metacrilato) o poli (N-isopropilacrilamida-cohidroxipropil metacrilato (HPM) -co-3-trimetoxisililpropil metacrilato (TMSPM) -co-dodecilmetacrilato) .
9. Un proceso para la preparación de un copolímero sensible a la temperatura de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 8, comprendiendo el proceso la polimerización de unidades monoméricas sensibles a la temperatura y una o más 35 unidades monoméricas hidrófobas y/o hidrófilas adicionales.
10. Un sustrato que tiene una superficie sobre la cual las células pueden crecer y dividirse en el cultivo, donde dicha superficie está recubierta con un recubrimiento de película polimérica formado a partir de un copolímero sensible a la temperatura como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y dicho recubrimiento de película polimérica está unido covalentemente a la superficie del sustrato.
11. Un sustrato de acuerdo con la reivindicación 10, donde el sustrato es un recipiente de cultivo celular.
12. Una solución de recubrimiento para recubrir la superficie de un sustrato, comprendiendo la solución de
recubrimiento un copolímero sensible a la temperatura como se define en las reivindicaciones 1 a 8 disuelto en un disolvente.
13. Un kit de partes que comprende un copolímero sensible a la temperatura como se define en las reivindicaciones 1 a 8 y un disolvente para disolver el copolímero para formar una solución que puede aplicarse posteriormente a la 50 superficie del sustrato.
14. Un método para formar un recubrimiento de película sensible a la temperatura sobre una superficie de un sustrato, comprendiendo dicho método disolver un copolímero sensible a la temperatura como se ha definido en las reivindicaciones 1 a 8 en un disolvente para formar una solución, aplicar la solución sobre la superficie del sustrato,
retirar el disolvente e hibridar el copolímero a la superficie del sustrato.
15. Un método para separar las células de la superficie de un sustrato que está recubierto con un copolímero sensible a la temperatura como se ha definido en las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el método enfriar el sustrato para hidratar el copolímero sensible a la temperatura y, de esta manera, separar las células presentes sobre 60 la superficie del sustrato.
16. Un método para cultivar células que comprende sembrar sobre un sustrato como se ha definido en las reivindicaciones 10 u 11 en presencia de un medio de cultivo y mantener la temperatura a una temperatura de incubación para permitir que las células crezcan y se dividan, y después reducir la temperatura para recoger las 65 células.
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