Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional.

Célula de animal no humano

(i) portadora de un ADN que codifica un anticuerpo,

y

(ii) que no presenta actividad de a1, 6-fucosiltransferasa para añadir fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor de las cadenas de azúcar unidas al N-glucósido, pudiendo obtenerse dicha célula eliminando el gen que codifica la a1, 6-fucosiltransferasa o añadiendo una mutación a dicho gen para eliminar la actividad de la a1, 6-fucosiltransferasa, en la que dichas cadenas de azúcar comprenden **Fórmula**

Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional.

Campo técnico

La presente exposición se refiere a un procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional, tal como un anticuerpo, una proteína o un péptido, un agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional, y una molécula inmunofuncional que tiene la actividad estimulada.

Técnica anterior

Dado que los anticuerpos tienen gran actividad de unión, especificidad de unión y gran estabilidad en la sangre, se han intentado sus aplicaciones al diagnóstico, prevención y tratamiento de diversas enfermedades humanas (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., capítulo 2.1 (1995) ) . Sin embargo, un anticuerpo proveniente de un animal no humano, tal como un anticuerpo de ratón, es reconocido como un material extraño cuando se administra a un ser humano, que de ese modo produce un anticuerpo humano contra el anticuerpo de ratón (anticuerpo humano antirratón: denominado en adelante "HAMA") en el cuerpo humano, y se sabe que el HAMA provoca efectos secundarios por reacción con el anticuerpo de ratón administrado (J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984) ; Blood, 65, 1349 (1985) ; J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1988) ; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 1242 (1985) ) , provoca la desaparición del anticuerpo de ratón administrado en la sangre (J. Nuc. Med., 26, 1011 (1985) ; Blood, 65, 1349 (1985) ; J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988) ) y reduce los efectos de diagnóstico, preventivos y terapéuticos del anticuerpo de ratón (J. Immunol., 135, 1530 (1985) ; Cancer Res., 46, 6489 (1986) ) .

A fin de resolver estos problemas, se ha intentado convertir un anticuerpo proveniente de un animal no humano en un anticuerpo humanizado, tal como un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo con región determinante de complementariedad injertada humano (denominada en adelante "RDC") , utilizando técnicas de recombinación génica. El anticuerpo híbrido humano es un anticuerpo en el que su región variable del anticuerpo (denominada en adelante "región V") es de un anticuerpo de un animal no humano y su región constante (denominada en adelante "región C") es de un anticuerpo humano (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851 (1984) ) . Se ha publicado de que la administración de dichos anticuerpos híbridos a seres humanos elimina efectos secundarios graves y la vida media en la sangre se prolongaba aproximadamente 6 veces en comparación con un anticuerpo de ratón (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 4220 (1989) ) . El anticuerpo humano injertado en la RDC es un anticuerpo en el que RDC de un anticuerpo humano se sustituye por la RDC de un anticuerpo no humano (Nature, 321, 522 (1986) ) . Se ha informado que, en una experimentación utilizando mono, la inmunogenicidad de un anticuerpo humano injertado en la RDC se redujo y su vida media en la sangre se prolongó 4 a 5 veces en comparación con un anticuerpo de ratón (J. Immunol., 147, 1352 (1991) ) . Estas publicaciones demuestran que un anticuerpo humanizado es de esperar que tenga suficientes efectos, como un anticuerpo que ha de aplicarse al diagnóstico, la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades humanas, aun cuando no sea un anticuerpo completamente humano. En realidad, se han realizado pruebas clínicas con anticuerpos antitumorales, tales como un anticuerpo híbrido humano anti-CD20, Rituxan (IDEC, Inc.) , y un anticuerpo humano injertado en la RDC anti-HER2/neu, Herceptin (Genentech, Inc.) . Los efectos de seguridad y terapéuticos del anticuerpo híbrido humano anti-CD20 y del anticuerpo humano injertado en la RDC anti-HER2/neu, hasta un cierto grado, se han confirmado en el linfoma B y cáncer de mama, respectivamente (J. Clin. Oncol., 16, 2825 (1998) ; J. National Cancer Institute, 90, 882 (1998) ) . Por otra parte, un fragmento (Fab') de un anticuerpo híbrido humano anti-GPIIb/IIIa, ReoPro (Centocor, Inc.) , está comercializado en Europa y América como fármaco para la prevención de una enfermedad secundaria después de angioplastia coronaria transluminal percutánea. Actualmente, un gran número de ensayos clínicos se están realizando con otros anticuerpos humanizados. La mayoría de estos anticuerpos humanizados se han preparado utilizando técnicas de recombinación génica y se han producido utilizando células animales apropiadas.

Se ha puesto de manifiesto que cinco clases de anticuerpos, es decir, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, están presentes en los mamíferos. Los anticuerpos de clase IgG humana se utilizan principalmente en el diagnóstico, prevención y tratamiento de varias enfermedades humanas, debido a su larga vida media en la sangre y a características funcionales, tales como varias funciones efectoras y similares (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., capítulo 2.1 (1995) ) . El anticuerpo humano de clase IgG se clasifica en los siguientes 4 subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Un gran número de estudios se han llevado a cabo hasta ahora para la actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (denominada en adelante "actividad de ADCC") y la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (denominada en adelante "CDC") como funciones efectoras del anticuerpo de clase IgG, y se ha publicado de que los anticuerpos de la subclase IgG1 tienen la mayor actividad de ADCC y actividad de CDC entre los anticuerpos humanos de la clase IgG (Chemical Immunology, 65, 88 (1997) ) . Por lo tanto, la mayor parte de los anticuerpos humanizados antitumorales que requieren una alta función efectora son anticuerpos de la subclase IgG1 humana, incluyendo Rituxan y Herceptin anteriores.

La expresión de la actividad de ADCC y actividad de CDC de los anticuerpos de la subclase IgG1 humana requiere la unión de la región Fc del anticuerpo a un receptor de anticuerpo existente en la superficie de una célula efectora,

tal como un linfocito citolítico, un linfocito citolítico natural, un macrófago activado o similar (denominado en adelante "FcyR") y diferentes componentes del complemento. Se ha sugerido que varios restos de aminoácidos en el segundo dominio de la región bisagra del anticuerpo y la región C (en adelante denominada "dominio Cy2") (Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993) , Immunology, 86, 319 (1995) , Chemical Immunology, 65, 88 (1997) ) y una cadena de azúcar unidada al dominio Cy2 también son importantes para esta reacción de unión (Chemical Immunology, 65, 88 (1997) ) . En cuanto a la cadena de azúcar, Boyd et al. han examinado los efectos de una cadena de azúcar en la actividad de ADCC y la actividad de CDC, al tratar un anticuerpo con RDC injertada humano, CAMPATH-1H (subclase IgG1 humana) , producido utilizando células de ovario de hámster chino (célula CHO) o células NS0 de mieloma de ratón con varias enzimas hidrolizantes de azúcar, y publicó que la eliminación de ácido siálico del terminal no reductor no tiene influencia sobre ambas actividades. Además la eliminación del resto de galactosa sin embargo se publicó que ejerce influencia en sólo la actividad de CDC, disminuyendo aproximadamente el 50% de su actividad. Se publicó que la eliminación completa de la cadena de azúcar que causa la desaparición de ambas actividades (Molecular Immunol., 32, 1311 (1995) ) . Por otra parte, Lifely et al. han analizado la cadena de azúcar de un anticuerpo con RDC injertada humano, CAMPATH-1H (subclase IgG1 humana) que se produjo utilizando células CHO, células NS0 o células YO de mieloma de rata, se determinó su actividad de ADCC y se publicó que el CAMPATH-1H proveniente de las células YO presenta la mayor actividad deADCC, lo que sugiere que Nacetilglucosamina en la posición bisectriz es importante para la actividad (Glycobiology, 5, 813 (1995) : documento WO 99/54342) . Estas publicaciones demuestran que la estructura de la cadena de azúcar desempeña una función importante en la función efectora de los anticuerpos de la subclase IgG1 humana, y que puede ser posible preparar un anticuerpo con mayor función efectora cambiando la estructura de cadena de azúcar. En realidad, sin embargo, las estructuras de las cadenas de azúcar son complejas y varían en gran medida. Resulta necesario por lo tanto estudiar más a fondo la estructura para obtener una función efectora mayor.

Descripción de la exposición Un objetivo de la presente descripción es especificar una cadena de azúcar que aumenta la actividad de ADCC, analizando las cadenas de azúcar de los anticuerpos de la subclase IgG1 humana producidos por varias células animales, y por lo tanto también proporcionar un procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional. Dado que la actividad de ADCC mejora en dichos anticuerpos, el aumento en el efecto terapéutico... [Seguir leyendo]

1. Célula de animal no humano (i) portadora de un ADN que codifica un anticuerpo, y

(ii) que no presenta actividad de a1, 6-fucosiltransferasa para añadir fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor de las cadenas de azúcar unidas al N-glucósido, pudiendo obtenerse dicha célula eliminando el gen que codifica la a1, 6-fucosiltransferasa o añadiendo una mutación a dicho gen para eliminar la actividad de la a1, 6-fucosiltransferasa, en la que dichas cadenas de azúcar comprenden 2. Célula anfitriona de animal no humano que no presenta actividad de a1, 6-fucosiltransferasa para añadir fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor de las cadenas de azúcar unidas al N-glucósido, pudiendo obtenerse dicha célula eliminando el gen que codifica la a1, 6-fucosiltransferasa o añadiendo una mutación a dicho gen para eliminar la actividad de la a1, 6-fucosiltransferasa, en la que dichas cadenas de azúcar comprenden 3. Célula anfitriona según la reivindicación 2 que puede producir un anticuerpo que presenta una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo estimulada (ADCC) , cuando el ADN que codifica dicho anticuerpo se introduce en dicha célula anfitriona.

4. Célula o célula anfitriona según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 que es una célula de mieloma de ratón, una célula de mieloma de rata, una célula de ovario de hámster chino o una célula de mono, en la que dicho gen que codifica la a1, 6-fucosiltransferasa se ha eliminado o se ha añadido a dicho gen una mutación.

5. Célula según la reivindicación 1 o célula anfitriona según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, en la que el

anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo con RDC injertada humano.

6. Procedimiento para producir un anticuerpo que comprende producir el anticuerpo en la célula según cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 o 5. 35

7. Procedimiento para producir un anticuerpo que tiene una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo estimulada (ADCC) que comprende introducir un ADN que codifica dicho anticuerpo en la célula anfitriona según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 y producir el anticuerpo en dicha célula.

8. Procedimiento según la reivindicación 6 o 7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo con RDC injertada humano.

9. Procedimiento para producir una célula, en el que la célula 45 (i) es portadora de un ADN que codifica un anticuerpo, y

(ii) presenta menor actividad o ninguna de a1, 6-fucosiltransferasa para añadir fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor de las cadenas de azúcar unidas al N-glucósido, y en el que dichas cadenas de azúcar comprenden

comprendiendo el procedimiento la eliminación del gen que codifica la a1, 6-fucosiltransferasa o la adición de una mutación a dicho gen para reducir o eliminar la actividad de a1, 6-fucosiltransferasa en comparación con la célula sin 5 dicha eliminación o mutación.

10. Procedimiento para producir una célula anfitriona que presenta menor actividad o ninguna de la a1, 6fucosiltransferasa para añadir fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor de las cadenas de azúcar unidas al N-glucósido, en el que dichas cadenas de azúcar comprenden

comprendiendo el procedimiento la eliminación del gen que codifica la a1, 6-fucosiltransferasa o la adición de una mutación a dicho gen para reducir o eliminar la actividad de la a1, 6-fucosiltransferasa en comparación con la célula 15 sin dicha eliminación o mutación.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la célula puede producir un anticuerpo que presenta una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo estimulada (ADCC) , cuando el ADN que codifica dicho anticuerpo se introduce en dicha célula anfitriona.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la célula es una célula de mieloma de ratón, una célula de mieloma de rata, una célula de ovario de hámster chino o una célula de mono.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano, 25 un anticuerpo humanizado, un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo con RDC injertada humano.

14. Procedimiento para producir un anticuerpo, comprendiendo el procedimiento (i) eliminar en una célula el gen que codifica la a1, 6-fucosiltransferasa o añadir una mutación a dicho gen para 30 reducir o eliminar la actividad de a1, 6-fucosiltransferasa en comparación con la célula sin dicha eliminación,

(ii) introducir un ADN que codifica un anticuerpo en dicha célula,

(iii) producir un anticuerpo en la célula. 35

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo con RDC injertada humano.

16. Célula según la reivindicación 2, que es una célula de mieloma de ratón, una célula de mieloma de rata, una

célula de ovario de hámster chino o una célula de mono, en la que se ha eliminado dicho gen que codifica la a-1, 6fucosiltransferasa o se ha añadido una mutación a dicho gen.