Conjugados de ubiquitina o de gamma cristalinas para la utilización en la terapia, el diagnóstico y la cromatografía.

Procedimiento para la preparación de un conjugado, que abarca los siguientes componentes:

una o varias moléculas polipeptídicas (I) basadas en la ubiquitina humana, y, unido(s) covalentemente con ésta, unoo varios componentes funcionales (II) que se escogen entre el conjunto formado por polipéptidos y proteínas,polímeros orgánicos, azúcares, sustancias de bajo peso molecular, péptidos, así como derivados de estassustancias,

realizándose que, después del acoplamiento de (I) a (II), la funcionalidad de todos los componentes permanececonservada,

y realizándose que el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) Puesta a disposición de la ubiquitina humana;

b) Puesta a disposición de un ligando, que se escoge entre el conjunto formado por unos/as(poli)péptidos/proteínas;

c) Selección de los aminoácidos 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 y 66 de la ubiquitina humana;

d) Modificación de los aminoácidos seleccionados mediante sustitución mediando conservación del motivo deplegamiento del tipo del de la ubiquitina;

e) Puesta en contacto de la proteína modificada con el ligando puesto a disposición en la etapa b);

f) Determinación de aquéllas proteínas, que son adecuadas para una fijación específica a los ligandos conuna constante de disociación de KD ≥ 10-5 M o menor, efectuándose la detección de la actividad de fijación através de la técnica ELISA o de una resonancia de plasmones superficiales;

g) Acoplamiento de los componentes (I) y (I) en una región situada fuera de la región expuestasuperficialmente de la lámina plegada ß de la molécula polipeptídica (I), que está prevista para la fijaciónespecífica al ligando, a través de una fusión terminal de péptidos con (I), o a través de unas cadenas lateralesde cisteína o lisina en (I);

h) Aislamiento del conjugado; y

i) Detección de la funcionalidad de ambos componentes del conjugado.

Conjugados de ubiquitina o de gamma cristalinas para la utilización en la terapia, el diagnóstico y la cromatografía El presente invento se refiere a un procedimiento para la preparación de un conjugado que comprende una o varias moléculas polipeptídicas basadas en la ubiquitina humana y una o varias partes componentes funcionales.

El documento de solicitud de patente internacional WO 01/04144 A divulga unos conjugados de una proteína con una estructura de lámina plegada beta (mutante gamma cristalina) , que se fija a estradiol. En particular, se describe la fusión terminal de mutantes gamma cristalinas con diversas moléculas, a saber con una marca E, con la proteína de recubrimiento minoritaria 3 así como con una marca His.

El documento WO 01/04144 A describe además el proceso de modificar unas proteínas estables de lámina plegada beta mediante una mutagénesis específica para un sitio en la lámina plegada beta junto a la superficie, de tal manera que a partir de la proteína no fijadora resulte una proteína con unas específicas propiedades de fijación.

La ubiquitina humana encuentra utilización como una proteína de entramado (en inglés scaffold) para la generación de unas moléculas fijadoras alternativas. La ubiquitina es una proteína pequeña, monomérica y citosólica, que se presenta - grandemente conservada en su secuencia - en todas las células eucarióticas conocidas, desde las de los protozoos hasta de los vertebrados. Ella desempeña en el organismo un cometido fundamental en el caso de la regulación de la degradación controlada de las proteínas propias de la célula.

La cadena polipeptídica de la ubiquitina se compone de 76 aminoácidos, que están plegados en una estructura alfa/beta extremadamente compacta (Vijay-Kumar, 1987) : Casi un 87 % de la cadena polipeptídica participa por medio de puentes de hidrógeno en la formación de los elementos estructurales secundarios. Como estructuras secundarias prominentes pueden ser válidos tres arrollamientos y medio en forma de hélice alfa así como una lámina plegada beta antiparalela, que se compone de cinco cadenas. La disposición característica de estos elementos - una lámina plegada beta antiparalela, expuesta hacia la superficie de la proteína, que es cubierta por su lado posterior por una hélice alfa que se sitúa verticalmente por encima de ésta - es válida por lo general como un denominado motivo de plegamiento del tipo del de la ubiquitina. Otra característica de la estructura es una pronunciada región hidrófoba en el interior de la proteína entre la hélice alfa y la lámina plegada beta.

La producción artificial de la ubiquitina es posible, debido a su pequeño tamaño, tanto mediante una síntesis química así como también mediante procedimientos biotecnológicos. A causa de las favorables propiedades de plegamiento, la ubiquitina puede ser producida en el caso de la obtención por tecnología genética con ayuda de unos microorganismos tales como p.ej. E. coli en unas cantidades relativamente grandes facultativamente en el citosol o en el recinto periplasmático.

La sencilla y eficaz producción bacteriana hace posible la utilización de la ubiquitina como un partícipe en una fusión para otras proteínas ajenas que deben de ser producidas, cuya producción es problemática. Mediante la fusión con la ubiquitina se puede conseguir una solubilidad mejorada y por consiguiente un rendimiento mejorado (Butt y colaboradores, 1989) .

Partiendo de los datos existentes presentes de estructuras cristalinas (registro en el banco de datos PDB: 1UBI) , mediante un análisis apoyado por ordenadores se pudieron localizar las posiciones de tales aminoácidos en el entramado proteínico de la ubiquitina, cuyas cadenas laterales están expuestas sobre la superficie, es decir que están orientadas hacia el disolvente o un potencial partícipe en la fijación. Las posiciones escogidas se encuentran en una proximidad espacial entre ellas junto al comienzo de la primera cadena terminal de la lámina plegada beta (las posiciones 2, 4, 6) así como en el bucle (en inglés loop) (las posiciones 62, 63) o respectivamente junto al comienzo de la cadena terminal de carboxi de la lámina plegada beta (las posiciones 64, 65, 66) y forman con sus cadenas laterales de aminoácidos una región coherente sobre la superficie de la ubiquitina. Mediante unas sustituciones aleatorias de aminoácidos en la región analizada, se generó así una región hipervariable, expuesta sobre la superficie, en la estructura proteínica de la ubiquitina que sigue estando intacta (véase el documento de patente PCT europea PCT/EP2004/005730, no publicado) .

La generación de una superficie artificial de fijación sobre una proteína de lámina plegada beta constituye una nueva e interesante alternativa a los anticuerpos habituales. Se pudo aportar la demostración de que un nuevo sitio de fijación generado artificialmente sobre la superficie de unas proteínas gamma cristalinas o similares a la ubiquitina conduce a unas moléculas fijadoras capaces de funcionar (véase el documento de solicitud de patente alemana DE 19932688 A1) (véase el documento PCT/EP2004/005730, no publicado) .

Sin embargo hasta ahora faltaba cualquier incitación o mención acerca de la posibilidad de acoplar estas moléculas polipeptídicas a un componente adicional para la formación de un conjugado, con el fin de hacerlas útiles para usos diagnósticos, terapéuticos y analíticos, sin sufrir en este caso una pérdida de función de uno de los dos componentes o de ambos.

El presente invento se basa por consiguiente en la misión de poner a disposición un procedimiento para la producción de un conjugado a base de un polipéptido basado en la ubiquitina y de un componente funcional, teniendo la respectiva molécula polipeptídica una propiedad de fijación modificada en comparación con el polipéptido de tipo silvestre para la fijación específica a un ligando, realizándose que ambos componentes del conjugado, después de su acoplamiento uno a otro, conservan su funcionalidad o ésta es incluso aumentada por el acoplamiento.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante el objeto de las reivindicaciones independientes. Unas formas preferidas de realización se establecen a partir de las reivindicaciones dependientes de ellas.

El presente invento se refiere al acoplamiento no dirigido, específico para un sitio y selectivo, de unas nuevas proteínas fijadoras, que se basan en la ubiquitina, a las más diversas moléculas, tales como p.ej. unas proteínas (proteínas de cromóforos y enzimas) , unas matrices (p.ej. de dextrano, un polimetacrilato, una agarosa, un Sepharose, derivados de un poliestireno y una celulosa) y unas moléculas pequeñas (por ejemplo, marcadores de fluorescencia, biotina, digoxigenina, radioisótopos, antibióticos, entre otros) . Estas moléculas, denominadas AffilinTM tienen en común el diseño "de novo" de una región de fijación en las estructuras de lámina plegada beta de las proteínas. Por consiguiente, ellas se diferencian de la clase más prominente de proteínas de fijación en la naturaleza, la de los anticuerpos, en los que la región de fijación está localizada en unas regiones flexibles de bucle (las CDR's, acrónimo de Complementar y Determining Regions = regiones determinantes de complementariedad) de la proteína. Otra diferencia entre las AffilinTM y los anticuerpos es el tamaño de las moléculas. Los polipéptidos empleados como base para el primer componente del conjugado conforme al invento poseen un peso molecular de 10 kDa (la ubiquitina) , y los anticuerpos poseen un peso molecular de 150 kDa (la IgG) .

El presente invento abarca un procedimiento para la preparación de unos conjugados a base de estos polipéptidos y de los correspondientes partícipes en el acoplamiento. Además, se ha descrito su empleo en diversos usos y se ha puesto de manifiesto sorprendentemente que estos métodos de acoplamiento no conducen ni a la pérdida de la actividad biológica del partícipe en el acoplamiento ni a la pérdida de las propiedades de fijación de los polipéptidos a sus ligandos.

A modo de ejemplo para el invento, se describen el acoplamiento de los componentes polipeptídicos a una matriz de dextrano en el sistema BIACORE, el acoplamiento al colorante fluorescente Oyster®556, a la proteína de cromóforo ficoeritrina (PE) y a la enzima peroxidasa de rábano rusticano, así como la inmovilización de un polipéptido a un material de soporte para la utilización en la cromatografía por afinidad. Conforme al invento, los acoplamientos se realizaron en este caso o bien directamente a la molécula polipeptídica, p.ej. a unas cadenas laterales nucleófilas de las proteínas, o de un modo dirigido... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación de un conjugado, que abarca los siguientes componentes:

una o varias moléculas polipeptídicas (I) basadas en la ubiquitina humana, y, unido (s) covalentemente con ésta, uno o varios componentes funcionales (II) que se escogen entre el conjunto formado por polipéptidos y proteínas, polímeros orgánicos, azúcares, sustancias de bajo peso molecular, péptidos, así como derivados de estas sustancias, realizándose que, después del acoplamiento de (I) a (II) , la funcionalidad de todos los componentes permanece conservada, y realizándose que el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) Puesta a disposición de la ubiquitina humana; b) Puesta a disposición de un ligando, que se escoge entre el conjunto formado por unos/as (poli) péptidos/proteínas; c) Selección de los aminoácidos 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 y 66 de la ubiquitina humana; d) Modificación de los aminoácidos seleccionados mediante sustitución mediando conservación del motivo de plegamiento del tipo del de la ubiquitina; e) Puesta en contacto de la proteína modificada con el ligando puesto a disposición en la etapa b) ; f) Determinación de aquéllas proteínas, que son adecuadas para una fijación específica a los ligandos con una constante de disociación de KD = 10-5 M o menor, efectuándose la detección de la actividad de fijación a través de la técnica ELISA o de una resonancia de plasmones superficiales; g) Acoplamiento de los componentes (I) y (I) en una región situada fuera de la región expuesta superficialmente de la lámina plegada º de la molécula polipeptídica (I) , que está prevista para la fijación específica al ligando, a través de una fusión terminal de péptidos con (I) , o a través de unas cadenas laterales de cisteína o lisina en (I) ; h) Aislamiento del conjugado; y i) Detección de la funcionalidad de ambos componentes del conjugado.

2. Procedimiento para la preparación de un conjugado tal como se ha definido en la reivindicación 1, partiendo de un componente (I) con una secuencia conocida, que abarca las siguientes etapas:

- Identificación de unos restos de aminoácidos adecuados para el acoplamiento mediante un análisis de la estructura espacial de la proteína, de manera preferida de unos restos situados fuera de la superficie de interacción de (I) con el ligando;

- Activación de un partícipe en el acoplamiento mediante un reactivo adecuado de acoplamiento;

- Realización de la reacción de acoplamiento:

- Aislamiento del conjugado; y

- Detección de la funcionalidad de ambos componentes del conjugado.

3. Procedimiento para la preparación de un conjugado tal como se ha definido en la reivindicación 1, partiendo de un componente (I) con una secuencia conocida, en el que no se había identificado ningún resto de aminoácido adecuado para el acoplamiento, que abarca las siguientes etapas:

- Introducción de unos restos de aminoácidos adecuados para el acoplamiento mediante sustitución, inserción o fusión, de manera preferida de unos restos expuestos sobre la superficie fuera de la superficie de interacción de (I) con los ligandos;

- Detección de la accesibilidad de los restos de aminoácidos introducidos;

- Detección de la funcionalidad del componente (I) modificado de esta manera;

- Activación de un partícipe en el acoplamiento mediante un adecuado reactivo de acoplamiento;

- Realización de la reacción de acoplamiento;

- Aislamiento del conjugado; y

- Detección de la funcionalidad de los componentes del conjugado.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, realizándose que el acoplamiento se efectúa a través de los restos de lisina 11, 29, 33 y 48 de la molécula de ubiquitina.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, realizándose que la adicional fusión terminal de péptidos con (I) contiene uno o varios restos de cisteína o uno o varios restos de lisina, realizándose que estos restos de aminoácidos no participan preferiblemente en la interacción de (I) con el ligando.

6. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-5, realizándose que el componente funcional

(II) es un péptido, un polipéptido o una proteína, de manera preferida una proteína de cromóforo, una enzima, una inmunoglobulina, un derivado de una inmunoglobulina, una toxina o un polipéptido de acuerdo con I.

7. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-5, realizándose que el componente funcional

(II) es un polímero, de manera preferida un dextrano, un polimetacrilato, un Sepharose, una agarosa, un polímero vinílico, un poliestireno, un gel de sílice, una celulosa, un poli (etilenglicol) o un derivado de un polímero.

8. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-5, realizándose que el componente funcional

(II) es una sustancia de bajo peso molecular, de manera preferida un colorante, biotina, digoxigenina, un metal pesado, un agente formador de quelatos, un radioisótopo, un antibiótico o una sustancia citotóxica.

9. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, realizándose que el componente

(I) tiene una propiedad de fijación generada de nuevas para la fijación específica a un ligando, que es un polipéptido

o una proteína, de manera preferida a unas inmunoglobulinas y unos derivados de inmunoglobulinas, unas proteínas obtenidas a partir del plasma sanguíneo, unos factores y unos inhibidores de la coagulación sanguínea, unas interleucinas, unas citocinas, unas proteínas de receptores, unas glicoproteínas, unas proteínas víricas y unos marcadores de la superficie celular, de manera preferida CD 14, CD 25, CD 34.

10. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, realizándose que el componente (I) tiene una propiedad de fijación generada de nuevas para la fijación específica a un ligando, que es un péptido, de manera preferida un apéndice de afinidad, de manera preferida una marca S, una marca His, una marca Strep, una marca Myc o una marca FLAG, o unos péptidos de procedencia vírica.

11. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, realizándose que el componente (I) tiene una propiedad de fijación generada de nuevas para la fijación específica a un ligando, que es una sustancia de bajo peso molecular, de manera preferida unos esteroides, colesterol y unas sustancias contaminantes, tales como, por ejemplo, unos hidrocarburos halogenados.

12. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, realizándose que el componente (II) es uno o varios polipéptidos basados en la ubiquitina, que son idénticos a (I) , y que están unidos por enlaces covalentes con éste, con lo cual se alcanza un aumento de la afinidad para los ligandos de (I) a través de unos efectos de avidez.

13. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, realizándose que el componente (II) es un polipéptido, una proteína o un polímero, con el/la que el componente (I) está unido múltiples veces por enlaces covalentes, con lo cual se alcanza un aumento de la afinidad para los ligandos de (I) a través de unos efectos de avidez.

14. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, realizándose que el componente (II) es un polipéptido o un polímero, el cual, después de haberse unido por enlaces covalentes con el componente (I) pasa a tomar parte de enlaces covalentes o no covalentes con otros conjugados de este tipo, con lo cual se alcanza un aumento de la afinidad para los ligandos de (I) a través de unos efectos de avidez.

15. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, realizándose que el componente (I) es SPU11-3-A1 (SEQ ID NO: 12 y 13) .

16. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, que abarca además la producción de un estuche diagnóstico con un conjugado preparado de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-15.

17. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, que abarca además la preparación de una composición farmacéutica con un conjugado preparado de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-15.

18. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, que abarca además la preparación de una composición para el enriquecimiento por afinidad con un conjugado preparado de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-15, realizándose que el componente funcional es una membrana, unas bolitas poliméricas o un material de soporte cromatográfico.

Figura 1: Figura 2: Figura 3: Figura 4:

Figura 6:

Figura 8:

Figura 10: Figura 11: