Un método para identificar proteínas de ubicuitina heteromultímeras modificadas con capacidad para unirse a ligandos.

Un método para identificar una ubicuitina modificada heteromultímera con capacidad de unión a un ligando,

que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una población de ubicuitina modificada heteromultímera procedente de proteínas de ubicuitina modificadas monómeras, comprendiendo dicha población proteínas heteromultímeras que comprendendos o más monómeros de ubicuitina unidos entre sí en una disposición de cabeza a cola en la que al menosuno de dichos monómeros de dicha proteína heteromultímera se modifica de forma diferente al menos mediantesustituciones de los aminoácidos expuestos en la superficie, en al menos tres aminoácidos situados enlas posiciones 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 y 68 de SEQ ID NO: 1, teniendo dicha proteína monómera modificada una identidad de secuencia aminoacídica de al menos 80% o al menos 90% o al menos 95% con la proteínaubicuitina sin modificar;

b) proporcionar un ligando potencial a dicha población de proteínas modificadas de forma diferente;

c) poner en contacto dicha población de proteínas modificadas de forma diferente con dicho ligando;

d) identificar una proteína heteromultímera modificada por un proceso de escrutinio, en donde dicha proteínaheteromultímera modificada se une a dicho ligando con una afinidad de unión específica de Kd en un intervalode 10-7 - 10-12 M y muestra una actividad de unión monovalente con respecto a dicho ligando; y opcionalmente

e) aislar dicha ubicuitina modificada heteromultímera con dicha afinidad de unión.

Un método para identificar proteínas de ubicuitina heteromultímeras modificadas con capacidad para unirse a ligandos Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para identificar ubicuitina heteromultímera con capacidad de unión a un ligando. Además, la invención proporciona genotecas de ADN que codifican una población de dichas proteínas de ubicuitina heteromultímeras así como bancos de proteínas obtenidos mediante la expresión de dichas genotecas de ADN, células y fagos que contienen dicho ADN o proteínas, polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión y vectores que comprenden dichos polinucleótidos. Además se proporcionan nuevas proteínas de unión que se basan en ubicuitinas heteromultímeras que son capaces de unirse específicamente con alta afinidad a ligandos seleccionados.

Antecedentes de la invención Existe una demanda creciente de moléculas de unión que consisten en aminoácidos que no sean inmunoglobulinas. Aunque hasta la fecha los anticuerpos representan la clase mejor establecida de moléculas de unión, todavía existe una necesidad de nuevas moléculas de unión con el fin de dirigirse a ligandos con alta afinidad y especificidad, ya que las moléculas de inmunoglobulina tienen grandes inconvenientes. A pesar de que se pueden producir con bastante facilidad y se pueden dirigir a casi cualquier diana, tienen una estructura molecular bastante compleja. Existe una necesidad actual de sustituir anticuerpos por moléculas más pequeñas que se puedan manejar de forma sencilla. Estos agentes de unión alternativos se pueden utilizar beneficiosamente, por ejemplo, en el campo de la medicina de diagnóstico, profilaxis y tratamiento de enfermedades.

Proteínas que tienen estructuras tridimensionales relativamente definidas, conocidas en general como armazones proteicos, se pueden utilizar como material de partida para el diseño de dichos agentes de unión alternativos. Estos armazones contienen típicamente una o varias regiones que son susceptibles de una variación específica o aleatoria de la secuencia, y tal aleatorización de la secuencia se realiza frecuentemente para producir un banco de proteínas a partir del cual se pueden seleccionar las moléculas de unión específicas. Se espera que moléculas con un tamaño menor que los anticuerpos y una afinidad comparable o incluso mejor hacia un antígeno diana, sean superiores a los anticuerpos en términos de propiedades farmacocinéticas e inmunogenicidad.

Una variedad de enfoques previos utilizan armazones proteicos como material de partida para proteínas de unión. Por ejemplo, en el documento WO 99/16873 se desarrollaron proteínas modificadas de la familia de la lipocalina (denominadas Anticalinas) que presentan actividad de unión a ciertos ligandos. La estructura de los péptidos de la familia de la lipocalina se modifica con sustituciones de aminoácidos en su bolsillo de unión al ligando natural, utilizando métodos de ingeniería genética. Como las inmunoglobulinas, las Anticalinas se pueden utilizar para identificar

o unir estructuras moleculares. De una manera análoga a los anticuerpos, las estructuras flexibles de bucle se modifican; estas modificaciones permiten el reconocimiento de ligandos diferentes a los naturales.

El documento WO 01/04144 describe la generación artificial de un dominio de unión en la superficie de una proteína en proteínas estructurales de lámina beta per se, que carecen de un sitio de unión. Por medio de este dominio de unión artificial generado de nuevo, por ejemplo, se pueden obtener variaciones artificiales en γ-cristalina -una proteína estructural de la lente ocular -que interaccionan con ligandos con alta afinidad y especificidad. En contraste con la modificación de sitios de unión que ya están presentes y se han formado a partir de estructuras flexibles de bucle, tal y como se ha mencionado anteriormente para las Anticalinas, estos dominios de unión se generan de novo en la superficie de láminas beta. Sin embargo, el documento WO 01/04144 solo describe la alteración de proteínas relativamente grandes para la generación de nuevas propiedades de unión. Debido a su tamaño, las proteínas de acuerdo con el documento WO 01/04144 pueden ser modificadas a nivel de ingeniería genética solo por métodos que requieren cierto esfuerzo. Además, en las proteínas descritas hasta ahora solo se ha modificado una proporción relativamente baja en porcentaje del total de aminoácidos, con el fin de mantener la estructura global de la proteína. Por lo tanto, solo está disponible una región relativamente pequeña de la superficie de la proteína, la cual se puede utilizar para la generación de propiedades de unión que no existían previamente. Por otra parte, el documento WO 01/04144 describe solamente la generación de una propiedad de unión para γ-cristalina.

El documento WO 04/106368 describe la generación de proteínas de unión artificiales basándose en proteínas de ubicuitina. La ubicuitina es una proteína pequeña, monómera y citosólica que está altamente conservada en su secuencia y está presente en todas las células eucariotas conocidas, desde protozoos hasta vertebrados. En el organismo desempeña un papel crucial en la regulación de la degradación controlada de proteínas celulares. Para este fin, las proteínas que se van a degradar se unen covalentemente a la ubicuitina o a cadenas de poliubicuitina durante su paso a través de una cascada enzimática y se degradan selectivamente debido a esta etiqueta. De acuerdo con recientes resultados, la ubicuitina o el etiquetado de proteínas a través de ubicuitina, respectivamente, tiene un papel importante también en otros procesos celulares, tales como la importación de varias proteínas o la regulación génica de las mismas.

Además de la aclaración de su función fisiológica, la ubicuitina es un objeto de la investigación, principalmente debi

do a sus propiedades estructurales y proteoquímicas. La cadena polipeptídica de la ubicuitina consiste en 76 aminoácidos plegados en una estructura α/β extraordinariamente compacta (Vijay-Kumar, 1987) : casi el 87% de la cadena polipeptídica está implicado en la formación de elementos estructurales secundarios por medio de enlaces de hidrógeno. Estructuras secundarias importantes son tres vueltas y media alfa-helicoidales, así como una lámina β antiparalela que consiste en cuatro hebras. La disposición característica de estos elementos -una lámina β antiparalela expuesta de la superficie de la proteína sobre cuyo lado posterior una hélice alfa está empaquetada, la cual se encuentra verticalmente en la parte superior de la misma -se considera generalmente como el denominado motivo de plegamiento de tipo ubicuitina. Una característica estructural adicional es una región hidrófoba pronunciada en el interior de la proteína entre la hélice alfa y la lámina β.

Debido a su pequeño tamaño, la preparación artificial de ubicuitina puede llevarse a cabo tanto por síntesis química como por medio de métodos biotecnológicos. Debido a las propiedades favorables del plegamiento, la ubicuitina se puede producir por ingeniería genética usando microorganismos tales como Escherichia coli, en cantidades relativamente elevadas, en el citosol o en el espacio periplásmico. Debido a las condiciones oxidantes que predominan en el periplasma, la última estrategia se reserva generalmente para la producción de proteínas secretoras. Debido a la preparación bacteriana sencilla y eficaz, la ubicuitina se puede utilizar como un ligando de fusión para preparar otras proteínas ajenas en las que la producción sea problemática. Por medio de la fusión a ubicuitina, se puede lograr una solubilidad mejorada y con ello una mejora del rendimiento de la producción.

En comparación con anticuerpos u otros armazones alternativos, las proteínas de unión artificiales que se basan en proteínas de ubicuitina (también conocidas como Affilin®) tienen las ventajas de tener pequeño tamaño y alta estabilidad, alta afinidad, alta especificidad, fabricación microbiana rentable y ajuste de la semivida en suero. Sin embargo, todavía hay una necesidad de desarrollar adicionalmente esas proteínas en términos de potencial inmunógeno, seguimiento rápido y predictivo del desarrollo preclínico y nuevos enfoques terapéuticos. Aunque el documento WO 04/106368 describe en general el uso de armazones de ubicuitina con el fin de obtener proteínas de unión artificiales, no se proporciona ninguna solución sobre cómo modificar y cómo seleccionar eficazmente una proteína ubicuitina modificada de este tipo, con el fin de obtener una afinidad de unión específica más elevada y específica a ligandos, tales como haptenos... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar una ubicuitina modificada heteromultímera con capacidad de unión a un ligando, que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una población de ubicuitina modificada heteromultímera procedente de proteínas de ubicuitina modificadas monómeras, comprendiendo dicha población proteínas heteromultímeras que comprenden dos o más monómeros de ubicuitina unidos entre sí en una disposición de cabeza a cola en la que al menos uno de dichos monómeros de dicha proteína heteromultímera se modifica de forma diferente al menos mediante sustituciones de los aminoácidos expuestos en la superficie, en al menos tres aminoácidos situados en las posiciones 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 y 68 de SEQ ID NO: 1, teniendo dicha proteína monómera modificada una identidad de secuencia aminoacídica de al menos 80% o al menos 90% o al menos 95% con la proteína ubicuitina sin modificar;

b) proporcionar un ligando potencial a dicha población de proteínas modificadas de forma diferente;

c) poner en contacto dicha población de proteínas modificadas de forma diferente con dicho ligando;

d) identificar una proteína heteromultímera modificada por un proceso de escrutinio, en donde dicha proteína heteromultímera modificada se une a dicho ligando con una afinidad de unión específica de Kd en un intervalo de 10-7 -10-12 M y muestra una actividad de unión monovalente con respecto a dicho ligando; y opcionalmente e) aislar dicha ubicuitina modificada heteromultímera con dicha afinidad de unión.

2. El método según la reivindicación 1, en donde dicha proteína heteromultímera es una proteína heterodímera o heterotrímera.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que dicha proteína monómera modificada comprende una o varias inserciones de un total de 1 a 10 aminoácidos y/o una o varias deleciones de un total de 1 a 7 aminoácidos, además opcionalmente, en donde dicha proteína ubicuitina monómera modificada comprende al menos 6 y como máximo 14 sustituciones de aminoácidos, y en donde dicha proteína ubicuitina heterodímera modificada comprende en total al menos 12 y como máximo 28 sustituciones, y/o comprende en total al menos 1 y como máximo 20 inserciones y/o al menos 1 y como máximo 14 deleciones.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha proteína ubicuitina monómera modificada se puede obtener mediante ingeniería genética del ADN que codifica la ubicuitina y la expresión de dicha proteína en organismos procariotas o eucariotas o in vitro.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha proteína multímera se proporciona mediante un método de selección in vitro que es preferentemente un método de presentación, opcionalmente un método de presentación en fagos, presentación ribosómica, presentación en fagos TAT, presentación en levaduras, presentación bacteriana, presentación en la superficie celular o presentación en ARNm.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho ligando es un antígeno o un hapteno.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde además 1 a 7 aminoácidos adicionales están sustituidos en al menos una de las proteínas de ubicuitina monómeras, los cuales se seleccionan opcionalmente entre uno o varios de los aminoácidos en las posiciones 36, 44, 70, 71 y, opcionalmente, además, 62, 63 y 64 o 72 y 73 u8 de SEQ ID NO: 1.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha población de proteínas de fusión heteromultímeras de ubicuitina se proporciona mediante la fusión genética de dos genotecas de ADN codificando cada una proteínas monómeras modificadas de forma diferente, traduciendo el ADN en proteínas de fusión heterodímeras, presentando dichas proteínas y escrutando las proteínas presentadas en presencia de proteínas de ubicuitina heteromultímeras modificadas que comprenden proteínas de ubicuitina monómeras que están enlazadas entre sí en una disposición de cabeza a cola en donde dichas proteínas de ubicuitina heteromultímeras modificadas se unen a dicho ligando con una afinidad de unión específica de Kd en un intervalo de 10-7 -10-12 M y muestran una actividad de unión monovalente con respecto a dicho ligando o en donde dicha población de proteínas de fusión heteromultímeras de ubicuitina se proporciona mediante síntesis química de las proteínas.

9. Una genoteca de ADN que contiene ADN que codifica una población de proteínas de fusión heteromultímeras de ubicuitina procedente de ubicuitinas monómeras, comprendiendo cada proteína multímera dos o más monómeros de ubicuitina modificados, enlazados entre sí en una disposición de cabeza a cola en donde al menos dos de cada uno de dichos monómeros de dicha proteína multímera están modificados de forma diferente al menos por sustituciones de aminoácidos expuestos en la superficie en al menos tres aminoácidos localizados en las posiciones 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 y 68 de SEQ ID NO: 1, teniendo dicha proteína monómera modificada una identidad de se

cuencia aminoacídica de al menos 80% o al menos 90% o al menos 95% con la proteína ubicuitina no modificada.

10. Un banco de proteínas de ubicuitina heteromultímeras obtenible mediante la expresión de la genoteca de ADN según la reivindicación 9.

11. Una célula eucariota o procariota o una población de fagos que contienen el ADN o el banco de proteínas según la reivindicación 9 o 10.

12. Un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de ubicuitina heteromultímera de dicho banco de proteínas según la reivindicación 10.

13. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 12.