Conjugación de péptidos mediante transglutaminasa.

Método para conjugar péptidos, dicho método incluyendo las etapas de

i) reaccionar en uno o más pasos un residuo de Gln con péptido representado por la fórmulacon un nitrógeno con nucleófilo (primer compuesto) representado por la fórmula

H2N-D-R-X

que incluye uno o más grupos funcionales o grupos latentes funcionales,

que son no accesibles en cualquiera de losresiduos de aminoácidos constituyendo dicho péptido, en presencia de transglutaminasa capaz de catalizar laincorporación de dicho primer compuesto en dicho péptido para formar un péptido transaminado de la fórmulay

ii) opcionalmente activar el grupo latente funcional X; y

iii) reaccionar en uno o más pasos dicho péptido transaminado con un segundo compuesto de la fórmulaY-E-Z

que incluye uno o más grupos funcionales, donde dicho(s) grupo(s) funcional(es) no reacciona(n) con gruposfuncionales accesibles en los residuos de aminoácidos constituyendo dicho péptido, y donde dicho(s) grupo(s)funcional(es) en dicho segundo compuesto es capaz de reaccionar con dicho(s) grupo(s) funcional(es) en dicho primercompuesto de modo que un enlace covalente entre dicho péptido transaminado y dicho segundo compuesto es formadodando como resultado un péptido conjugado de la fórmula

donde D representa un enlace u oxígeno;

R representa un enlazador o un enlace;

X representa un radical que comprende un grupo funcional o un grupo latente funcional no accesible en los residuos deaminoácido que constituyen el péptido P-C(O)-NH2;

Y representa un radical que comprende uno o más grupos funcionales estos grupos reaccionando con gruposfuncionales presentes en X, y estos grupos funcionales no reaccionando con grupos funcionales accesibles en elpéptido P-C(O)-NH2;

E representa un enlazador o un enlace;

A representa una fracción de oxima, hidrazona, fenilhidrazona, semicarbazona, triazol o isooxazolidina, la fracciónformada por la reacción entre los grupos funcionales comprendidos en X y Y; y

Z es la fracción que debe ser conjugada al péptido.

Conjugación de péptidos mediante transglutaminasa Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a un método nuevo para conjugación postraduccional de péptidos donde transglutaminasa se utiliza para incorporar un punto de fijación en el péptido al cual otro grupo puede ser selectivamente unido. Dichos péptidos conjugados han alterado características y pueden así ser usados en aplicaciones terapéuticas o pueden facilitar el análisis o aislamiento y purificación de dichos péptidos.

Antecedentes de la invención [0002] Es bien conocido que modificar las propiedades y características de péptidos conjugando grupos al péptido cambia debidamente las propiedades del péptido. Tal conjugación requiere generalmente algún grupo funcional en el péptido para reaccionar con otro grupo funcional en un grupo de conjugación. Típicamente, grupos de amino, tal como el grupo de amino de N-terminal o el grupo de £-amino en lisinas, han sido usados en combinación con un reactivo adecuado acilante. Es frecuentemente deseado o incluso requerido para ser capaz de controlar la reacción de conjugación, es decir para controlar dónde los compuestos de conjugación se fijan y para controlar cuántos grupos de conjugación son fijados. Esto frecuentemente se denomina especificidad.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método mediante el cual péptidos se puedan conjugar con un alto grado de especificidad. En términos generales, el método aprovecha una enzima, por ejemplo transglutaminasa, capaz de incorporar un compuesto que comprende un grupo adecuado funcional en el péptido, dónde dicho grupo funcional es posteriormente usado como un punto donde conjugar.

La conjugación de péptidos en general ha sido conocida por mucho tiempo, y US 4.179.337 describió hace más de 20 años péptidos conjugados con polietileno o polipropilenglicoles.

Diferentes tipos de químicas han sido descritas como eficaces en la formación de un enlace entre el péptido y la fracción a ser conjugada con el péptido. EP 605 963 divulga la injertación de polímeros acuosos que forman una conexión de oxima con un grupo de aldehído en una proteína. Ninguno de los aminoácidos naturales comprende un aldehído, así un grupo hidróxilo tiene que ser oxidado como un primer paso del proceso de conjugación. WO 96/41813 divulga polímeros que se funcionalizan con una oxima de amino-oxi formando grupo útil en las reacciones de conjugación. WO 98/05363 divulga un compuesto que comprende un péptido y un polímero hidrosoluble, donde los dos son de manera covalente conectados a través de un enlace de oxima al residuo de aminoácido N-terminal.

Derivados de hormona de crecimiento humana (hGH) de tamaño en aumento producido al reaccionar hGH con un éster de N-hidroxisuccinimida de polietileno glicol-5000 (PEG5000) , un 5-kDa reactivo que selectivamente conjuga con aminas primarias, han sido descritos por Clarke et al. (JBC 271, 21969 (1996) ) . WO 02/055532 describe hGH y variantes de hGH y una variedad de opciones para la conjugación de dicho polipéptido con una sustancia macromolar.

Además, el uso de enzimas para permitir una conjugación más específica de péptidos es conocido. EP 243 929 divulga el uso de enzimas proteolíticas, tal como carboxipeptidasa para incorporar un compuesto con un grupo funcional en el C-terminal de un péptido, dónde dicho grupo funcional puede posteriormente ser usado como un punto donde pegar grupos citotóxicos, otros péptidos o grupos indicadores usados para facilitar análisis del péptido, tal como por ejemplo grupos fluorescentes. Esta técnica, no obstante, limita el punto de fijación al residuo de aminoácido C-terminal, algo que constituye una limitación severa si el residuo C-terminal es esencial para la actividad del péptido.

Transglutaminasa ha sido usada previamente para alterar las propiedades de péptidos. En la industria alimentaria y en particular en la industria de diario muchas técnicas están disponibles para por ejemplo vincular péptidos usando transglutaminasas. Otros documentos revelan el uso de transglutaminasa para alterar las propiedades de péptidos fisiológicamente activos inclusive EP 950665 y EP 785276. Sato et al (Bioconjug.Chem 11, 502-509 (2000) ) y Sato et al (Adv. Fármaco Del. Girar. 54, 487-504 (2002) ) revelan la reacción directa entre un sustrato peptídico que comprende uno o dos sitios de sustrato TGase (incluyendo uno o dos Residuos de Gln) en una secuencia de péptidos fundida Nterminalmente a IL-2 y una PEG funcionalizada de amina o ligandos similares en presencia de transglutaminasa. Wada in Biotech. Lett., 23, 1367-1372, 2001 divulga la conjugación directa de [-lactoglobulina con ácidos grasos mediante transglutaminasa.

Resumen de la invención [0009] Los presentes inventores han sorprendentemente encontrado que enzimas, tal como por ejemplo transglutaminasa, se pueden utilizar para incorporar en un péptido uno o más grupos funcionales, que no son accesibles en el péptido para formar un péptido funcionalizado, y que este péptido funcionalizado puede posteriormente ser reaccionado con otro compuesto que comprende una fracción de conjugación y uno o más grupos funcionales capaces de reacción con el grupo o grupos funcionales así incorporados en el péptido.

Tal método proporciona un alto grado de especificidad en que transglutaminasa puede sólo catalizar la incorporación de compuestos a residuos de aminoácidos que son sustratos para transglutaminasa, y en que los grupos funcionales se seleccionan de modo que ellos sólo reaccionan entre sí, no con otros grupos funcionales accesibles en el péptido. De esta manera, la fracción de conjugación sólo se une a localizaciones o lugares geométricos controlados, y por selección de los grupos funcionales, el número de grupos conjugados puede ser controlados.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para conjugar péptidos, dicho método incluye las siguientes etapas i) reaccionar en uno o más pasos un residuo de Gln con péptido representado por la formula con un nitrógeno con nucleófilo (primer compuesto) representado por la fórmula H N-D-R-X

que comprende uno o más grupos funcionales o grupos latentes funcionales, que son no accesibles en cualquiera de los aminoácidos constituyendo dicho péptido, en presencia de transglutaminasa capaz de catalizar la incorporación de dicho primer compuesto en dicho péptido para formar un péptido transaminado de la fórmula y ii) opcionalmente activar dicho grupo latente funcional X, y

iii) reaccionar en uno o más pasos dicho péptido transaminado con un segundo compuesto de la fórmula Y-E-Z

que comprende uno o más grupos funcionales, donde dicho grupo (s) funcional no reacciona con grupos funcionales accesibles en los residuos de aminoácidos constituyendo dicho péptido, y donde dicho grupo (s) funcional en dicho segundo compuesto es capaz de reacción con dicho grupo (s) funcional en dicho nitrógeno con nucleófilo (primer compuesto) de modo que un enlace covalente entre dicho péptido transaminado y dicho segundo compuesto es formado dando como resultado un péptido conjugado de la formula donde D representa un enlace u oxígeno; R representa un enlazador o un enlace; X representa un radical que comprende un grupo funcional o un grupo latente funcional no accesible en los residuos de aminoácido que constituyen el péptido P-C (O) -NH2; Y representa un radical que comprende uno o más grupos funcionales estos grupos reaccionan con grupos funcionales presentes en X, y estos grupos funcionales no reaccionan con grupos funcionales accesibles en el péptido P-C (O) -NH2; E representa un enlazador o un enlace; A representa una oxima, hidrazono, fenilhidrazona, semicarbazona, triazol o fracción de isooxazolidina, la fracción formada por la reacción entre los grupos funcionales comprendida en X e Y; y Z es la fracción a ser conjugada al péptido.

Péptidos conjugados por el método de la presente invención también se describen. Péptidos que son en cierto modo modificados para hacerlos más adecuados para el método de la presente invención son también mencionados

aquí.

Reactivos y enzimas adecuados para uso en los métodos de la presente invención son posteriormente descritos.

Péptidos conjugados según los métodos de la presente invención para uso en la terapia son también descritos.

Métodos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades que comprenden la administración de péptidos conjugados preparados según los métodos de la presente invención son también descritos.

Es también otro objetivo de la presente invención proporcionar un método para mejorar las propiedades farmacológicas... [Seguir leyendo]

1. Método para conjugar péptidos, dicho método incluyendo las etapas de i) reaccionar en uno o más pasos un residuo de Gln con péptido representado por la fórmula con un nitrógeno con nucleófilo (primer compuesto) representado por la fórmula

HN-D-R-X

que incluye uno o más grupos funcionales o grupos latentes funcionales, que son no accesibles en cualquiera de los 10 residuos de aminoácidos constituyendo dicho péptido, en presencia de transglutaminasa capaz de catalizar la incorporación de dicho primer compuesto en dicho péptido para formar un péptido transaminado de la fórmula y ii) opcionalmente activar el grupo latente funcional X; y

iii) reaccionar en uno o más pasos dicho péptido transaminado con un segundo compuesto de la fórmula Y-E-Z

que incluye uno o más grupos funcionales, donde dicho (s) grupo (s) funcional (es) no reacciona (n) con grupos funcionales accesibles en los residuos de aminoácidos constituyendo dicho péptido, y donde dicho (s) grupo (s) funcional (es) en dicho segundo compuesto es capaz de reaccionar con dicho (s) grupo (s) funcional (es) en dicho primer compuesto de modo que un enlace covalente entre dicho péptido transaminado y dicho segundo compuesto es formado dando como resultado un péptido conjugado de la fórmula donde D representa un enlace u oxígeno; R representa un enlazador o un enlace; X representa un radical que comprende un grupo funcional o un grupo latente funcional no accesible en los residuos de aminoácido que constituyen el péptido P-C (O) -NH2; Y representa un radical que comprende uno o más grupos funcionales estos grupos reaccionando con grupos funcionales presentes en X, y estos grupos funcionales no reaccionando con grupos funcionales accesibles en el péptido P-C (O) -NH2; E representa un enlazador o un enlace; A representa una fracción de oxima, hidrazona, fenilhidrazona, semicarbazona, triazol o isooxazolidina, la fracción formada por la reacción entre los grupos funcionales comprendidos en X y Y; y

Z es la fracción que debe ser conjugada al péptido.

2. Método según la reivindicación 1, donde el grupo funcional o grupo latente funcional comprendido en X se selecciona de o puede ser activado para ceto-, aldehído-, -NH-NH2, -O-C (O) -NH-NH2, -NH-C (O) -NH-NH2, -NH-C (S) -NH-NH2, NHC (O) -NH-NH-C (O) -NH-NH2, -NH-NH-C (O) -NH-NH2, -NH-NH-C (S) -NH-NH2, -NH-C (O) -C6H4-NH-NH2, -C (O) -NH-NH2, -O

NH2, -C (O) -O-NH2, -NH-C (O) -O-NH2, -NH-C (S) -O-NH2, alquina, azida o nitril-óxido.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, donde el grupo funcional presente en Y es seleccionado de entre ceto-, aldehído-, -NH-NH2, -O-C (O) -NH-NH2, -NH-C (O) -NH-NH2, -NH-C (S) -NH-NH2, -NHC (O) -NH-NH-C (O) -NH-NH2, NH-NH-C (O) -NH-NH2, -NH-NH-C (S) -NH-NH2, -NH-C (O) -C6H4-NH-NH2, -C (O) -NH-NH2, -O-NH2, -C (O) -O-NH2, -NH-C (O) -O

NH2, -NH-C (S) -O-NH2, alquina, azida y nitril-óxido.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde X se selecciona de o se puede activar para derivados de aldehído o de ceto, e Y se selecciona de -NH-NH2, -O-C (O) -NH-NH2, -NH-C (O) -NH-NH2, -NH-C (S) -NH-NH2, -NHC (O) -NH-NH-C (O) -NH-NH2, -NH-NH-C (O) -NH-NH2, -NH-NH-C (S) -NH-NH2, -NH-C (O) -C6H4-NH-NH2, -C (O) -NH-NH2, -O-NH2,

C (O) -O-NH2, -NH-C (O) -O-NH2, y-NH-C (S) -O-NH2

5. Método según la reivindicación 4, donde el grupo latente comprendido en X es seleccionado entre donde R9 es seleccionado entre H, C1-6 alquilo, arilo y heteroarilo.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde X e Y cada uno representa un elemento diferente del grupo que consiste en alquina y triazol, o del grupo que consiste en alquina y nitril-óxido.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho nitrógeno con nucleófilo se selecciona de 4 (aminometil) fenil etanona, 4- (2-aminoetil) fenil etanona, N- (4-acetilfenil) 2-aminoacetamida, 1-[4- (2aminoetoxi) fenil]etanona, 1-[3- (2-aminoetoxi) fenil]etanona, 1, 4-bis (aminoxi) butano, 3-oxapentano-1, 5-dioxiamino, 1, 8diaminoxi-3, 6-dioxaoctano, 1, 3-bis (aminoxi) propan-2-ol, 1, 11-bis (aminoxi) -3, 6, 9-trioxaundecano, 1, 3-diamino-2propanol, 1, 2-bis (aminoxi) etano, y 1, 3-bis (aminoxi) propano.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde Z comprende uno o más PEG o radicales de mPEG y derivados de amino de los mismos (incluido PEG ramificado y lineal y radicales de mPEG) ; alquilo C1-22 lineal, ramificado y/o cíclico, alquenilo C2-22, alquinilo C2-22, heteroalquilo C1-22, heteroalquenilo C2-22, heteroalquinilo C2-22, donde uno o más biradicales de compuesto aromático homocíclico o biradicales de compuesto heterocíclico pueden ser 20 insertados, y donde dichos radicales C1-C22 o C2-C22 pueden ser opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados de hidróxilo, halógeno, carboxilo, heteroarilo y arilo, donde dicho arilo o heteroarilo puede opcionalmente ser sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de hidróxilo, halógeno, y carboxilo; radicales de esteroide; radicales lípidos; radicales polisacáridos; dextranos; radicales de poliamida; radicales de ácido poliamínico; radicales de PVP; radicales de PVA; poli (1-3-dioxalano) ; poli (1, 3, 6-trioxano) ; polímero de etileno/anhídrido maléico; materiales de tinte de Cibacron; o azul Cibacron 3GA.

9. Método según la reivindicación 8, donde Z comprende uno o más PEG o radicales de mPEG con un peso molecular alrededor de entre 10 kDa y 40 kDa.

10. Método según la reivindicación 9, donde Z representa uno o más PEG o radicales de mPEG con un peso molecular alrededor de entre 10 kDa, 20kDa, 30 kDa o 40 kDa.

11. Método según la reivindicación 8, donde Z comprende uno o más alquilo C10-20.

12. Método según la reivindicación 6, donde Z comprende uno o más alquilo C15, alquilo C17, azul Cibacron 3GA o radical de la fórmula 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la enzima es transglutaminasa aislada de 40 Streptomyces mobaraenese, Streptomyces lydicus o hígado de conejillo de Indias.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde P representa un péptido seleccionado de insulina, péptido 1 similar a glucagón (GLP-1) , péptido 2 similar a glucagón (GLP-2) , hormona de crecimiento, citokinas, TFF, modificadores de receptores de melanocortina y compuestos de Factor VII.

15. Método según la reivindicación 14, donde P representa la hormona de crecimiento.