Compuestos reticulados, y métodos de preparación y uso de los mismos.

Un compuesto que tiene la fórmula I:**Fórmula**

en la que:

Y-C(O) es un resto de una macromolécula,

que es un polipéptido, una glucoproteína, un polisacárido, unaproteína o un polímero sintético; y

n ≥ 2 o 3,

en la que Y-C(O) es un resto de una macromolécula distinta al hialuronano.

Compuestos reticulados, y métodos de preparación y uso de los mismos

Antecedentes El uso de macromoléculas en aplicaciones farmacéuticas ha recibido una atención considerable. A veces, es deseable acoplar dos o más macromoléculas para producir nuevos armazones de macromoléculas con múltiples actividades. Sin embargo, las tecnologías existentes usadas para acoplar dos o más macromoléculas presentan 10 numerosas dificultades. Por ejemplo, las condiciones alcalinas o las altas temperaturas necesarias para crear hidrogeles con alta resistencia mecánica son pesadas y duras. Aunque el uso de agentes de reticulación para producir armazones macromoleculares ha tenido cierto éxito, los agentes de reticulación suelen ser moléculas citotóxicas relativamente pequeñas, y el armazón resultante se ha de extraer o lavar muy bien para eliminar las trazas de los reactivos sin reaccionar y subproductos (Hennink, W. E.; van Nostrum, C. F. Adv. Drug Del. Rev. 2002,

54, 13-36) , lo que impide su uso en muchas aplicaciones médicas. Se necesita un armazón macromolecular fisiológicamente compatible que se pueda producir de una manera directa antes de que sea útil como ayuda terapéutica. En el presente documento, se describen compuestos y métodos que son capaces de acoplar dos o más moléculas, tales como macromoléculas, en condiciones suaves.

Resumen de las realizaciones En el presente documento, se describen compuestos reticulados. También se describen en el presente documento métodos de preparación y uso de los compuestos reticulados.

Vista desde un primer aspecto, la invención proporciona un compuesto que tiene la fórmula I:

en la que:

Y-C (O) es un resto de una macromolécula, que es un polipéptido, una glucoproteína, un polisacárido, una proteína o un polímero sintético; y n = 2 0 3, en la que Y-C (O) es un resto de una macromolécula distinta de hialuronano.

Vista desde un segundo aspecto, la invención proporciona un método para acoplar dos o más compuestos, que comprende hacer reaccionar un grupo tiol de un primer compuesto, de acuerdo con el primer aspecto de la invención, con un grupo reactivo con tiol de al menos un segundo compuesto que comprende el grupo funcional reactivo con tiol, formando así un compuesto acoplado en el que cuando el grupo funcional reactivo con tiol es un tiol, la reacción se produce en presencia de un oxidante.

Vista desde un tercer aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un compuesto acoplado que se puede obtener de acuerdo con el método del segundo aspecto de la invención.

Vista desde un cuarto aspecto, la invención proporciona el uso de una composición del tercer aspecto de la invención para la fabricación de un medicamento para administrar un factor de crecimiento, un agente 45 antiinflamatorio, un agente contra el cáncer, un analgésico, un agente antiinfeccioso, un agente contra la unión a células, células vivas o para mejorar la cicatrización de heridas en un sujeto.

Vista desde un quinto aspecto, la invención proporciona el uso de la composición del tercer aspecto de la invención, que comprende un fármaco terapéutico o células vivas, para la fabricación de un medicamento para administrar 50 células vivas, migración celular, mejorar el crecimiento celular o la regeneración de tejido en un sujeto.

Vista desde un sexto aspecto, la invención proporciona una composición del tercer aspecto de la invención para su uso en un método para administrar un factor de crecimiento, un agente antiinflamatorio, un agente contra el cáncer, un analgésico, un agente antiinfeccioso, un agente contra la unión a células, células vivas o para mejorar la 55 cicatrización de heridas en un sujeto.

Vista desde un séptimo aspecto, la invención proporciona una composición del tercer aspecto de la invención, que comprende un fármaco terapéutico o células vivas, para su uso en un método para administrar células vivas, migración celular, mejorar el crecimiento celular o la regeneración de tejido en un sujeto.

Las ventajas de la invención, en parte, se expondrán en la descripción que se presenta a continuación y, en parte, se harán evidentes a partir de la descripción, o se pueden aprender mediante la práctica de las realizaciones descritas más adelante. Las ventajas descritas más adelante se realizarán y conseguirán por medio de los elementos y las combinaciones señaladas en particular en las reivindicaciones anexas.

Breve descripción de las figuras Las Figuras incluidas que se incorporan en y constituyen una parte de la presente memoria descriptiva, ilustran varios aspectos descritos a continuación.

La Figura 1 muestra el esquema de reacción para la producción de derivados tiolados de HA. La Figura 2 muestra (a) la absorción a 242 nm en función del pH para la solución de HA-DTPH y HA-DTBH; y (b) la representación logarítmica del log [ (Amax-Al) /AI] frente al pH. Los valores de pKa corresponden a la intersección con el eje de abscisas. La Figura 3 muestra el hinchamiento de películas de HA-DTPH y HA-DTBH en PBS a pH 7, 4. Los círculos y triángulos abiertos son las películas acopladas mediante oxidación con H2O2 al 0, 3 % tras la oxidación del aire, y los círculos y triángulos cerrados son películas acopladas únicamente por la oxidación del aire. La Figura 4 muestra el contenido de disulfuro en las películas de HA-DTPH y HA-DTBH. Clave: a = solo oxidación del aire; b = oxidación del aire seguida de la oxidación con H2O2. La Figura 5 muestra la liberación de azul de dextrano a partir de HA-DTPH en PBS que contiene diferentes concentraciones de DTT a pH 7, 4. La Figura 6 muestra la proliferación de fibroblastos en hidrogel de HA-DTPH tras un cultivo in vitro de 0, 1, 2 y 3 días. La Figura 7 muestra la síntesis de HA tiolado y gelatina. La Figura 8 muestra el efecto de la concentración de sal en la formación de complejos de polielectrolitos en soluciones mixtas de HA-gelatina. Se disolvieron HA-DTPH y gelatina-DTPH, ambos al 3, 0 % (p/v) , en PBS 0, 02 M, se ajustó el pH a 7, 4 (3, 0 % p/v) y, a continuación, se mezclaron las soluciones en diferentes proporciones. Se determinó la absorción a los 15 min (círculos abiertos, sin sal añadida) y 2 h (diamantes abiertos, NaCl al 1, 0 %) tras la preparación de la solución en una celda espectrofotométrica de 0, 5 cm. La Figura 9 muestra la determinación de la densidad de disulfuro en películas de gelatina de HA-DTPH-hidrogel de DTPH. Las películas de hidrogel se prepararon con polímero al 3, 0 % (p/v) en PBS 0, 02 M (pH 7, 4) con NaCl al 1, 0 % (p/v, y luego se hidrolizaron exhaustivamente en ácido (n = 3) . Se usaron reactivos de NTSB y DTNB como se ha descrito para obtener los contenidos totales de azufre y tiol. Se calculó la densidad teórica de disulfuro (círculos abiertos) a partir de la densidad de tiol (0, 77 mmol/g de HA-DTPH, 0, 51 mmol/g de gelatina-DTPH) . La Figura 10 muestra la relación de hinchamiento de equilibrio de las películas de HA-gelatina. La relación se midió en PBS a 37 ºC, 300 rpm (n = 3) . Las películas de hidrogel se prepararon con polímero al 3, 0 % (p/v) en PBS 0, 02 M (pH 7, 4) con NaCl al 1, 0 % (p/v) . La Figura 11 muestra la degradación enzimática de las películas mixtas de HA-gelatina. La pérdida de peso de las películas de hidrogel de HA-gelatina en soluciones enzimáticas de 300 U/ml (HAsa, triángulos abiertos; colagenasa, cuadrados abiertos; círculos abiertos, HAsa más colagenasa) a 37 ºC, 150 rpm (n = 3) . Panel A: HA-gelatina, 20:80. Panel B: HA-gelatina, 40:60. Las películas de hidrogel se prepararon con polímero al 3, 0 % (p/v) en PBS 0, 02 M (pH 7, 4) con NaCl al 1, 0 % (p/v) . La Figura 12 muestra la unión de las células y la difusión de los fibroblastos de películas de HA-gelatina. Imágenes microscópicas fluorescentes de fibroblasto 3T3 de Balb/c adherente y difundido en la superficie de películas de hidrogel de HA-gelatina tras 24 h de cultivo in vitro. Las células se sembraron inicialmente a 25.000 células/cm2 y se tiñeron con F-DA. Panel a: película de HA al 100 %; Panel b: HA-gelatina, 80:20; Panel c: HAgelatina, película de 40:60; y Panel d: película de gelatina-DTPH al 100 %. Ampliación original: paneles a, b, c y d x 100. La Figura 13 muestra la proliferación de fibroblasto 3T3 de Balb/c sobre la superficie de película de hidrogel de HA-gelatina. Las células se sembraron inicialmente a 5.000 células/cm2 y se determinó el número de células mediante el ensayo de MTT tras un día y tres días de cultivo in vitro (n = 5) . Como control, se usó poliestireno (PS) de cultivo de tejidos, y la densidad relativa de células en el poliestireno de cultivo de tejidos tras un día de cultivo in vitro se define como 1,... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto que tiene la fórmula I:

en la que:

Y-C (O) es un resto de una macromolécula, que es un polipéptido, una glucoproteína, un polisacárido, una proteína o un polímero sintético; y 10 n = 2 o 3,

en la que Y-C (O) es un resto de una macromolécula distinta al hialuronano.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que la macromolécula es un glucosaminoglucano sulfatado. 15

3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que la macromolécula es un polisacárido seleccionado de entre sulfato de condroitina, dermatano, heparano, heparina, sulfato de dermatano, sulfato de heparano, ácido algínico, pectina o carboximetilcelulosa.

4. El compuesto de la reivindicación 2, en el que el glucosaminoglucano sulfatado es sulfato de condroitina o heparina.

5. El compuesto de la reivindicación 1, en el que la macromolécula es un polímero sintético seleccionado de entre ácido glucurónico, ácido poliacrílico, ácido poliaspártico, ácido politartárico, ácido poliglutámico o ácido polifumárico. 25

6. El compuesto de la reivindicación 1, en el que la macromolécula es una proteína que aparece de modo natural o una proteína recombinante.

7. El compuesto de la reivindicación 1, en el que la macromolécula es una proteína de la matriz extracelular, una

proteína de la matriz extracelular modificada químicamente o un derivado parcialmente hidrolizado de una proteína de la matriz extracelular.

8. El compuesto de la reivindicación 7, en el que la proteína es colágeno, elastina, gelatina, decorina, laminina o fibronectina. 35

9. El compuesto de la reivindicación 1, donde n es igual a 3.

10. El compuesto de la reivindicación 1, en el que n es igual a 2.

11. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Y-C (O) es un resto de una proteína o polisacárido.

12. Un método para acoplar dos o más compuestos que comprende hacer reaccionar un grupo tiol de un primer compuesto según lo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con un grupo reactivo con tiol de al menos un segundo compuesto que comprende el grupo funcional reactivo con tiol, formándose así un compuesto 45 acoplado en el que cuando el grupo funcional reactivo con tiol es un tiol, la reacción se produce en presencia de un oxidante.

13. El método de la reivindicación 12 en el que el grupo funcional reactivo con tiol es un tiol, y el primer y el segundo compuestos son iguales o diferentes. 50

14. El método de la reivindicación 12, en el que el segundo compuesto comprende un grupo funcional electrófilo reactivo con tiol seleccionado de entre maleimida, vinilsulfona, acrilonitrilo, α-metilenéster, metiluro de quinona, éster de acriloílo, amida de acriloílo, α-halo-éster y α-haloamida.

15. El método de la reivindicación 12, en el que el segundo compuesto es un agente de reticulación que tiene dos grupos vinilo deficientes en electrones que son iguales.

16. El método de la reivindicación 15, en el que el agente de reticulación está seleccionado de entre un diacrilato, un dimetacrilato, una diacrilamida y una dimetilacrilamida.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el agente de reticulación homobifuncional es un éster o una amida 5 α, β-insaturados de poli (etilenglicol) .

18. El método de la reivindicación 13, en el que el segundo compuesto es una macromolécula seleccionada de entre un polipéptido, una glucoproteína, un polisacárido o un compuesto farmacéuticamente aceptable.

19. El método de la reivindicación 13, en el que el segundo compuesto es un compuesto tiolado que tiene al menos un grupo SH y es un polisacárido según lo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, ácido hialurónico o una proteína.

en la que Z-C (O) es un resto de una macromolécula; y

L es un grupo polialquileno, un grupo poliéter, un grupo poliamida, un grupo poliimino, un grupo arilo, un poliéster 20 o un grupo politioéter.

21. El método de la reivindicación 20, en el que la macromolécula, Z, es un polipéptido o una glucoproteína según lo definido en la reivindicación 1.

22. El método de la reivindicación 20, en el que la macromolécula, Z, es un polisacárido, una proteína o un polímero sintético según lo definido en la reivindicación 1.

23. El método de la reivindicación 20, en el que Z-C (O) es un resto de hialuronano y L es CH2CH2 o CH2CH2CH2. 30 24. El método de la reivindicación 20, en el que Z-C (O) es un resto de gelatina y L es CH2CH2 o CH2CH2CH2.

25. El método de la reivindicación 13, en el que el oxidante comprende un gas que comprende gas de oxígeno.

26. El método de la reivindicación 25, en el que el oxidante comprende además peróxido de hidrógeno. 35

27. El método de la reivindicación 12, en el que:

(a) el primer compuesto es una proteína; y

(b) el segundo compuesto es un polisacárido o un polímero sintético que tiene al menos un grupo SH. 40

28. El método de la reivindicación 27, en el que el segundo compuesto corresponde a la fórmula II:

en la que Z-C (O) es un resto de un polisacárido o un polímero sintético que comprende un grupo carboxilo; y

L es un grupo polialquileno, un grupo poliéter, un grupo poliamida, un grupo poliéster, un grupo poliimino, un grupo arilo o un grupo politioéter.

29. El método de la reivindicación 28, en el que L es CH2CH2 o CH2CH2CH2.

30. El método de la reivindicación 28, en el que Z-C (O) es un resto de hialuronano.

31. El método según lo reivindicado en la reivindicación 13, en el que el segundo compuesto comprende al menos dos grupos reactivos con tiol.

32. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 31, que comprende además combinar un fármaco terapéutico con un compuesto acoplado.

33. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 31, que comprende además combinar in vitro células vivas con el compuesto acoplado.

34. Una composición que comprende el compuesto acoplado obtenible de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 31.

35. La composición de la reivindicación 34 que comprende además un fármaco terapéutico o células vivas.

36. La composición de la reivindicación 35, en la que la composición comprende células vivas seleccionadas de entre fibroblastos, hepatocitos, condrocitos, células madre, médula ósea, células musculares, miocitos cardíacos, células neuronales y células de los islotes pancreáticos, en la que las células madre no son células madre embrionarias humanas.

37. Uso de una composición de una cualquiera de las reivindicacione.

3. 36 para la fabricación de un medicamento para la administración de un factor de crecimiento, un agente antiinflamatorio, un agente contra el cáncer, un analgésico, un agente antiinfeccioso, un agente contra la unión a células, células vivas o para mejorar la cicatrización de heridas en un sujeto.

38. La composición de la reivindicación 34, que es un hidrogel reticulable in situ.

39. Uso de una composición de la reivindicación 35 o de la reivindicación 36 para la fabricación de un medicamento para liberación de células vivas, migración celular, mejora del crecimiento celular o regeneración tisular en un sujeto.

40. El uso de la reivindicación 37, en el que el medicamento está en una forma adecuada para la inyección.

41. El uso de la reivindicación 37, para la fabricación de un medicamento para tratar adherencias postquirúrgicas, potenciar el crecimiento cutáneo, prevenir la formación de cicatrices, curar heridas, viscocirugía, viscosuplementación e ingeniería de tejidos.

42. Una composición de una cualquiera de las reivindicacione.

3. 36 para su uso en un método para la administración de un factor de crecimiento, un agente antiinflamatorio, un agente contra el cáncer, un analgésico, un agente antiinfeccioso, un agente contra la unión a células, células vivas o para mejorar la cicatrización de heridas en un sujeto.

43. Una composición de la reivindicación 35 o de la reivindicación 36 para su uso en un método para administración de células vivas, migración celular, potenciación del crecimiento celular o regeneración tisular en un sujeto.