Compuestos de FVIIA diméricos y multiméricos.

Compuesto de FVIIa multimérico o dimérico que contiene, como mínimo,

dos polipéptidos de FVIIa unidos medianteenlace covalente, para retener la actividad catalítica intrínseca de los polipéptidos de FVIIa, donde dicho compuestotiene una actividad biológica superior a la de los polipéptidos de FVIIa del constituyente, y en el que, al menos, dospolipéptidos de FVIIa están conectados de manera covalente por cisteínas producidas mediante ingeniería genética, endichos polipéptidos de FVIIa.

Compuestos de FVIIa dimericos y multimericos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a nuevos compuestos de FVIIa, métodos para su síntesis, composiciones farmacéuticas que comprenden los nuevos compuestos, así como su uso en el tratamiento de trastornos de la coagulación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El factor de coagulación VIIa (FVIIa) es el iniciador clave de la hemostasia. Es una proteína de plasma de 50 kDa con una vida media circulatoria funcional alrededor de 1-3 horas. El zimógeno, el FVII, es una proteína monocatenaria que es catalíticamente inactiva y puede ser convertida en el FVIIa bicatenario catalíticamente activa mediante la escisión de un enlace peptídico interno de Arg152-Ile153. El FVIIa se utiliza ampliamente como proteína terapéutica para el tratamiento de diversos trastornos de la coagulación que pueden ser causados por deficiencias de factores de coagulación o inhibidores del factor de coagulación. El FVIIa se ha utilizado también para controlar el sangrado excesivo observado en sujetos con una cascada de coagulación de sangre que funciona de forma normal. Tal sangrado puede, por ejemplo, ser causado por una función plaquetaria defectuosa, trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand, así como durante la cirugía y otras formas de daño tisular.

Para muchas de las aplicaciones terapéuticas de FVIIa es deseable llevar a cabo el tratamiento usando variantes de FVIIa con propiedades mejoradas en relación con el FVIIa nativo. Un área donde las variantes de FVIIa con actividad biológica mejorada son deseables es el tratamiento de hemorragias no controladas que son parcial o totalmente refractarias a la terapia con rFVIIa convencional debido a la potencia subóptima del FVIIa. En la actualidad las, así llamadas, variantes del FVIIa súper activas se pueden dividir en dos clases según su modo de acción. Un grupo abarca variantes con la mejora de la actividad proteolítica resultante de un cambio en el equilibrio conformacional de la proteína hacia el estado catalíticamente competente, véase, por ejemplo, Persson et al. (2001a) , (2001b) , (2002) , (2004) y Soejima et al. (2002) . El otro grupo es principalmente variantes con dominios GLA optimizados que muestran un aumento de la afinidad para fosfolípidos aniónicos de membranas (Shah et al. (1998) , Nelsestuen et al. (2001) y Harvey et al. (2003) ) . Se cree que una unión de fosfolípidos mejorada sirve para localizar y concentrar el FVIIa en la membrana de las plaquetas activadas en el sitio de la lesión vascular fomentando con ello la hemostasia.

La modificación covalente, por ejemplo, mediante pegilación o unión de lípidos, se ha aplicado con éxito en varios productos farmacéuticos basados en proteínas para mejorar sus perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos. La conjugación a través de cisteínas nativas o desarrolladas por ingeniería genética proporciona un atractivo medio de modificación específica del sitio debido a la rareza de este aminoácido en la superficie de las proteínas, en particular aquellas secretadas por la célula, así como la alta selectividad de la química de acoplamiento de tioles. La falta de tioles libres en el Factor VIIa nativo ha dado lugar a la propuesta de que la prolongación de la vida media en circulación podría lograrse mediante la modificación, por ejemplo, pegilación, de cisteínas expuestas a disolvente desarrolladas por ingeniería genética, véase, por ejemplo, el documento WO 02/077218 A1 y WO 01/58935 A2 .

Por lo tanto, el documento WO 01/58935 A2 divulga conjugados de FVIIa con fracciones no polipeptídicas y su preparación. En general, se sugiere que la fracción no polipeptídica está conjugada con el polipéptido de FVIIa a través de una cisteína. Asimismo, el documento WO 02/077218 A1 divulga conjugados polipéptidos de FVIIa con grupos químicos y su preparación. En general, se sugiere que el grupo químico está conjugado con el polipéptido de FVIIa a través de una cisteína.

En la práctica, sin embargo, este enfoque no siempre garantiza compuestos de FVIIa con la combinación óptima de perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos, es decir, alta actividad, vida media circulatoria prolongada, etc.

Por lo tanto, existe una necesidad de compuestos del FVIIa mejorados que muestren una alta actividad específica, una vida media de plasma prolongada, así como propiedades físico-químicas aceptables en relación con la fabricación, manipulación y formulación.

El documento WO 03/076461 divulga antagonistas diméricos del factor tisular y su uso en el tratamiento de, por ejemplo, enfermedades vasculares y enfermedades inflamatorias.

El documento SE 9501285A divulga un proceso para la producción in vitro de proteínas de disulfuro reticulado biológicamente activas y apropiadamente plegadas que utilizan una mezcla de una una proteína disulfuro oxidorreductasa (p. ej. proteína disulfuro isomerasa (PDI) ) , una glutarredoxina y un tampón redox. La referencia se centra en cisteínas involucradas en enlaces disulfuro intramoleculares.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Con el fin de superar las limitaciones anteriormente mencionadas de los compuestos conocidos del FVIIa, la presente invención proporciona ahora compuestos diméricos y multiméricos del FVIIa que comprenden al menos dos polipéptidos del FVIIa conectados covalentemente de manera que retengan la actividad catalítica intrínseca de los polipéptidos del FVIIa. Tales compuestos de FVIIa han mostrado sorprendentemente ser súper activos y se cree que presentan una mayor afinidad por la membrana como resultado del efecto de avidez que surge cuando dos o más polipéptidos del FVIIa están unidos covalentemente.

En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto del FVIIa en el que dos polipéptidos del FVIIa están conectados covalentemente para formar un compuesto dímero del FVIIa. En una forma de realización, los polipéptidos del FVIIa están conectados covalentemente a través de cisteínas desarrolladas por ingeniería genética en dichos polipéptidos del FVIIa. En otra forma de realización, dos polipéptidos idénticos del FVIIa están conectados covalentemente para formar un compuesto dímero del FVIIa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto dimérico o multimérico del FVIIa que comprende un enlazador entre los polipéptidos constituyentes de FVIIa.

El término "retener la actividad catalítica intrínseca" se refiere a la propiedad de que los polipéptidos diméricos o multiméricos de FVIIa tienen sustancialmente la misma actividad peptidolítica que la de los polipéptidos constituyentes de FVIIa, por ejemplo, una concentración de sitio activo que es al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, tal y como se mide por el ensayo divulgado en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Identificación de los tioles de bajo peso molecular que participan en disulfuros mixtos con FVIIa 407C. La proteína fue incubada en presencia de TCEP y SBD-f para liberar y derivatizar los tioles unidos al Cys407 desarrollado por ingeniería genética en la preparación de FVIIa 407C. Tioles derivatizados con SBD se separaron mediante HPLC de fase inversa y se detectaron mediante fluorescencia (longitudes de onda de excitación y emisión de 386 y 516 nm, respectivamente) . Trazas de HPLC de FVIIa de tipo salvaje y una serie de compuestos de tiol de bajo peso molecular (10 pmol de cada uno; norma indicada) se muestran para su comparación. Los valores máximos marcados con asterisco surgen de impurezas en la cisteamina comercialmente disponible. Los dos asteriscos indican un valor máximo de identidad desconocida en la traza de HPLC de FVIIa 407C. Los porcentajes sobre cada punto máximo indican la cantidad de una especie de tiol determinado (identificados a partir de su tiempo de retención) en relación con la cantidad de FVIIa 407C analizado. En base a los tiempos de retención, se puede concluir que los principales tioles conjugados con FVIIa 407C son el glutatión, la cisteína y la homocisteína. Abreviaturas: GSH (glutatión) , y-GC (yglutamilcisteína) , CG (cisteinilglicina) , Cys (cisteína) , Hcy (homocisteína) y Cya (cisteamina) .

Figura 2: Actividad amidolítica residual de FVIIa incubado a pH 7 en presencia de concentraciones variables de glutatión reducido y oxidado (dado por la proporción [GSH]2/[GSSG]) , 1 IM de levadura glutaredoxina 1 (yGrx1p) , y bien nada (círculos abiertos) o p-aminobenzamidina 25 mM (cuadrados abiertos) . Todas las muestras se dejaron equilibrar durante 3, 5 horas a 30 ºC antes de medir la actividad amidolítica. Las actividades amidolıticas se normalizan a 1 para FVIIa totalmente... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de FVIIa multimérico o dimérico que contiene, como mínimo, dos polipéptidos de FVIIa unidos mediante enlace covalente, para retener la actividad catalítica intrínseca de los polipéptidos de FVIIa, donde dicho compuesto tiene una actividad biológica superior a la de los polipéptidos de FVIIa del constituyente, y en el que, al menos, dos polipéptidos de FVIIa están conectados de manera covalente por cisteínas producidas mediante ingeniería genética, en dichos polipéptidos de FVIIa.

2. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dos polipéptidos de FVIIa se encuentran conectados por enlace covalente para formar un compuesto de FVIIa dimérico.

3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichos polipéptidos de FVIIa conectados por enlace covalente son polipéptidos de FVIIa idénticos.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos dos polipéptidos de FVIIa diferentes se encuentran conectados mediante un enlace covalente.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho compuesto de FVIIa multimérico o dimérico contiene un enlace entre los polipéptidos FVIIa constituyentes.

6. Compuesto según la reivindicación 5, donde dicho enlace tiene la estructura resultante de una reacción con un PEG reactivo de cisteína bivalente.

7. Compuesto según la reivindicación 5, donde dicho enlace tiene la estructura resultante de una reacción con maleimida-PEG-maleimida.

8. Compuesto según la reivindicación 7, donde dicho maleimida-PEG-maleimida se selecciona del grupo maleimidaPEG2kD-maleimida, maleimida-PEG3.4kD-maleimida, maleimida-PEG5kD-maleimida, maleimida- PEG10kD-maleimida, y maleimida-PEG20kD-maleimida.

9. Compuesto según la reivindicación 5, donde dicho enlace contiene una secuencia de aminoácidos.

10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho polipéptido de FVIIa es FVIIa 407C.

11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho polipéptido de FVIIa es una variante de FVIIa 407C.

12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho polipéptido de FVIIa es un FVIIa P406C o una variante de P406C FVIIa.

13. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho polipéptido de FVIIa es un FVIIa R396C o una variante de FVIIa R396C.

14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones, donde dicho polipéptido de FVIIa es un FVIIa Q250C o una variante de FVIIa Q250C.

15. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichos polipéptidos de FVIIa son variantes de FVIIa con dominios GLA optimizados, por ejemplo combinaciones de Y4 (inserción) , P10Q, K32E, D33F, D33E, y A34E.

16. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichos polipéptidos de FVIIa son variantes de FVIIa con mayor actividad proteolítica intrínseca, por ejemplo M298Q FVIIa, V158D/E296V/M298Q FVIIa, V158D/E296V/M298Q/K337A FVIIa, F374Y/L305V-FVlla, F374Y/L305V/S314E/K337A-FVIIa, F374Y/L305V/S314E-FVIIa, F374Y/L305V/K337A-FVIIa, L305V/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa, V158T/M298Q-FVIIa, E296V/M298Q-FVIIa, V158D/E296V-FVIIa, V158D/M298Q-FVIIa y sus variantes 407C.

17. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde dicha variante de FVIIa se selecciona del grupo compuesto por L305V-FVIIa, L305V/M306D/D309S-FVIIa, L305I-FVlla, L305T-FVIIa, F374P-FVIIa, V158T/M298Q-FVIIa, V158D/E296V/M298Q-FVIIa, K337A-FVIIa, M298Q-FVIIa, V158D/M298Q-FVIIa, L305V/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa, K157A-FVIIa, E296V-FVIIa, E296V/M298Q-FVlla, V158D/E296V-FVIIa, V158D/M298K-FVIIa, S336G-FVIIa, L305V/K337A-FVIIa, L305V/V158D-FVIIa, L305V/E296V-FVIIa, L305V/M298Q-FVIIa, L305V/V158T-FVIIa, L305V/K337A/V158T-FVIIa, L305V/K337A/M298Q-FVIIa, L305V/K337A/E296V-FVIIa, L305V/K337A/V158D-FVIIa, L305V/V158D/M298Q-FVIIa, L305V/V158D/E296V-FVIIa, L305V/V158T/M298Q-FVIIa, L305V/V158T/E296V-FVIIa, L305V/E296V/M298Q-FVIIa, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVIIa, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVIIa, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVIIa, L305V/V158T/E296V/K337A-FVIIa, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVIIa,

L305V/V158D/E296V/K337A-FVIIa, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, S314E/K316H-FVIIa, S314E/K316Q-FVIIa, S314E/L305V-FVIIa, S314E/K337A-FVIIa, S314E/V158D-FVIIa, S314E/E296V-FVIIa, S314E/M298Q-FVIIa, S314E/V158T-FVIIa, K316H/L305V-FVIIa, K316H/K337A-FVIIa, K316H/V158D-FVIIa, K316H/E296V-FVIIa, K316H/M298Q-FVIIa, K316H/V158T-FVIIa, K316Q/L305V-FVIIa, K316Q/K337A-FVIIa, K316Q/V158D-FVIIa, K316Q/E296V-FVIIa, K316Q/M298Q-FVIIa, K316Q/V158T-FVIIa, S314E/L305V/K337A-FVIIa, S314E/L305V/V158D-FVIIa, S314E/L305V/E296V-FVIIa, S314E/L305V/M298Q-FVIIa, S314E/L305V/V158T-FVIIa, S314E/L305V/K337A/V158T-FVlla, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVIIa, S314E/L305V/K337A/E296V-FVIIa, S314E/L305V/K337AN158D-FVIIa, S314E/L305VN158D/M298Q-FVIIa, S314E/L305V/V158D/E296V-FVIIa, S314E/L305VN158T/M298Q-FVIIa, S314E/L305V/V158T/E296V-FVIIa, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVIIa, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVIIa, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVIIa, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVIIa, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVIIa, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVIIa, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVIIa, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, K316H/L305V/K337A-FVIIa, K316H/L305V/V158D-FVIIa, K316H/L305V/E296V-FVIIa, K316H/L305V/M298Q-FVIIa, K316H/L305V/V158T-FVIIa, K316H/L305V/K337A/V158T-FVIIa, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVIIa, K316H/L305V/K337A/E296V-FVIIa, K316H/L305V/K337A/V158D-FVIIa, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVIIa, K316H/L305V/V158D/E296V-FVIIa, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVIIa, K316H/L305V/V158T/E296V-FVIIa, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVIIa, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVIIa, K316H/L305VN158T/E296V/M298Q-FVIIa, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVIIa, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVIIa, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVIIa, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVIIa, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, K316Q/L305V/K337A-FVIIa, K316Q/L305V/V158D-FVIIa, K316Q/L305V/E296V-FVIIa, K316Q/L305V/M298Q-FVIIa, K316Q/L305V/V158T-FVIIa, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVIIa, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVIIa, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVIIa, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVIIa, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVIIa, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVIIa, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVIIa, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVIIa, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVIIa, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVIIa, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVIIa, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVIIa, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVIIa, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVIIa, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A FVIIa, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVIIa y sus variantes 407C.

18. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichos polipéptidos de FVIIa están pegilados.

19. Compuesto que consiste en una combinación de albúmina de suero humano o una variante de la misma y un compuesto de FVIIa multimérico o dimérico, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

20. Composición farmacéutica que contiene un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1-19 y un portador

o excipiente farmacéuticamente aceptable.

21. Uso de un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, para la producción de un medicamento para el tratamiento de trastornos de sangrado o episodios de sangrado en un sujeto o para la mejora del sistema hemostático normal.

22. Método para la preparación de un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, dicho método consta de las siguientes etapas:

a) síntesis y purificación de dichos polipéptidos de FVIIa;

b) síntesis de dicho compuesto por acoplamiento de dichos polipéptidos de FVIIa;

c) aislamiento de dicho compuesto de FVIIa multimérico o dimérico.

23. Método para la preparación de un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, dicho método consta de las siguientes etapas: a) síntesis y purificación de dichos polipéptidos de FVIIa;

b) reducción selectiva del residuo de cisteína en los polipéptidos de FVIIa que van a unirse;

c) síntesis de dicho compuesto de FVIIa multimérico o dimérico por acoplamiento de dichos polipéptidos de FVIIa con residuos de cisteína reducida en presencia de un enlace activado;

d) aislamiento de dicho compuesto de FVIIa multimérico o dimérico.

24. Método según la reivindicación 23, donde el paso b) incluye reducción selectiva del residuo de cisteína en el polipéptido de FVIIa por reacción con un tampón redox o un agente reductor como la triarilfosfina.