Composiciones y procedimientos de control de infestaciones de insectos en plantas.

Una composición que contiene dos o más agentes pesticidas diferentes,

cada uno tóxico para la misma plaga delgusano de la raíz del maíz, en la que el primer agente pesticida es una molécula de ARNb que funciona suprimiendo unafunción biológica esencial en una o más células de la plaga del gusano de la raíz del maíz, y en la que el segundo agentepesticida es una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis.

Composiciones y procedimientos de control de infestaciones de insectos en plantas Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, al control genético de infestaciones de plagas en plantas y en y sobre animales. Más específicamente, la presente invención se refiere a los procedimientos para modificar la expresión endógena de secuencias codificantes en la célula o tejido de una plaga particular. Más específicamente, la presente invención utiliza tecnologías de ADN recombinante para reprimir o inhibir postranscripcionalmente la expresión de una secuencia codificante diana en la célula de una plaga, alimentando a la plaga una o más moléculas de ácido ribonucleico (ARN) bicatenario o interferente pequeño transcrito a partir de toda o una parte de una secuencia codificante diana,

controlándose así la infestación. Por tanto, la presente invención se refiere a inhibición específica de secuencias de expresión de secuencias codificantes usando ARN bicatenario (ARNb) o ARN interferente pequeño (ARNip) para lograr los niveles previstos de control de plagas.

También se proporcionan novedosas moléculas de ácidos nucleicos aisladas y sustancialmente purificadas que incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos y construcciones de ADN recombinante que no se producen naturalmente 15 para transcribir las moléculas de ARNb o ARNip de la presente invención que suprimen o inhiben la expresión de una secuencia codificante endógena o una secuencia codificante diana en la plaga cuando se introduce en la misma. También se proporcionan plantas transgénicas que (a) contienen secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas de ácidos nucleicos aisladas y sustancialmente purificadas y las construcciones de ADN recombinante que no se producen naturalmente para transcribir las moléculas de ARNb o ARNip para controlar infestaciones de plagas en plantas, y (b)

muestran resistencia y/o tolerancia potenciada a las infestaciones de insectos. También se describen composiciones que contienen las secuencias de nucleótidos de ARNb de la presente invención para su uso en aplicaciones tópicas sobre plantas o sobre animales o en el entorno de un animal para lograr la eliminación o reducción de infestación de plagas.

Antecedentes de la invención El entorno en el que los seres humanos viven está repleto de infestación de plagas. Plagas que incluyen insectos,

arácnidos, crustáceos, hongos, bacterias, virus, nematodos, platelmintos, ascárides, oxiuros, anquilostomas, tenias, tripanosomas, esquistosomas, éstridos, pulgas, garrapatas, ácaros y piojos son ubicuas en el entorno humano, y se ha utilizado una multitud de medios para intentar controlar infestaciones por estas plagas. Las composiciones para controlar infestaciones de plagas microscópicas tales como bacterias, hongos y virus se han proporcionado en forma de composiciones de antibiótico, composiciones antivirales y composiciones antifúngicas. Las composiciones para controlar

infestaciones de plagas mayores tales como nematodos, platelminto, ascárides, oxiuros, gusanos del corazón, tenias, tripanosomas y esquistosomas han sido normalmente en forma de composiciones químicas que pueden tanto aplicarse a las superficies de sustratos sobre las que se sabe que infestan las plagas, como ser ingeridas por un animal infestado en forma de pellas, polvos, comprimidos, pastas o cápsulas. La presente invención se refiere a proporcionar un medio mejorado para controlar la infestación de plagas en comparación con las composiciones conocidas en la técnica.

Los cultivos comerciales son frecuentemente las dianas de ataque de los insectos. Se ha hecho sustancial progreso en las últimas décadas hacia desarrollar procedimientos y composiciones más eficaces para controlar infestaciones de insectos en plantas. Los pesticidas químicos han sido muy eficaces en erradicar infestaciones de plagas. Sin embargo, hay varias desventajas de usar agentes pesticidas químicos. Los agentes pesticidas químicos no son selectivos. Las aplicaciones de pesticidas químicos están previstas para controlar plagas de invertebrados que son perjudiciales para diversos cultivos y

otras plantas. Sin embargo, debido a la falta de selectividad, los agentes pesticidas químicos también ejercen sus efectos sobre fauna no diana, esterilizando frecuentemente eficazmente un campo durante un periodo de tiempo sobre el que se han aplicado los agentes pesticidas. Los agentes pesticidas químicos persisten en el entorno y generalmente son de metabolización lenta, si lo son. Se acumulan en la cadena alimentaria, y particularmente en especies de predadores superiores. Las acumulaciones de estos agentes pesticidas químicos produce el desarrollo de resistencia a los agentes y

en especies superiores hasta la cadena evolutiva, actúan de mutágenos y/o carcinógenos causando frecuentemente modificaciones genéticas irreversibles y perjudiciales. Así, ha habido una necesidad que se sentía desde hace tiempo por procedimientos respetuosos con el medioambiente para controlar o erradicar infestación de insectos sobre o en plantas, es decir, procedimientos que sean selectivos, medioambientalmente inertes, no persistentes y biodegradables, y que se ajusten bien en los esquemas de gestión de resistencia de plagas.

Las composiciones que incluyen bacterias Bacillus thuringiensis (B.t.) han estado comercialmente disponibles y se han usado como insecticidas medioambientalmente seguros y aceptables durante más de treinta años. El efecto insecticida de bacterias Bt se produce como resultado de proteínas que son exclusivamente producidas por estas bacterias que no persisten en el entorno, que son altamente selectivas en cuanto a las especies diana afectadas, ejercen sus efectos solo tras la ingestión por una plaga diana, y se ha mostrado que son inofensivas para plantas y otros organismos no diana,

que incluyen seres humanos. Las plantas transgénicas que contienen uno o más genes que codifican proteína de B.t.

insecticida también están disponibles en la materia y son sorprendentemente eficaces en controlar la infestación de plagas de insectos. Un resultado sustancial del uso de plantas recombinantes que expresan proteínas insecticidas de Bt es una marcada disminución en la cantidad de agentes pesticidas químicos que se aplican al entorno para controlar la infestación de plagas en campos de cultivo en áreas en las que tales cultivos transgénicos se usan. La disminución en la aplicación de agentes pesticidas químicos ha producido tierras más limpias y aguas más limpias que corren de las tierras a las corrientes de alrededor, ríos, estanques y lagos. Además de estos beneficios medioambientales, ha habido un aumento perceptible en los números de insectos beneficiosos en los campos de cultivo en los que se cultivan cultivos transgénicos resistentes a insectos debido a la disminución en el uso de agentes insecticidas químicos.

Se ha informado de procedimientos y composiciones antisentido en la materia y se cree que ejercen sus efectos mediante la síntesis de una molécula de ARN monocatenario que en teoría se hibrida in vivo con una molécula de ARN de hebra codificante sustancialmente complementaria. La tecnología antisentido ha sido difícil de emplear en muchos sistemas por tres motivos principales, Primero, la secuencia antisentido expresada en la célula transformada es inestable. Segundo, la inestabilidad de la secuencia antisentido expresada en la célula transformada crea concomitantemente dificultad en la administración de la secuencia a un huésped, tipo de célula o sistema biológico remoto de la célula transgénica. Tercero,

las dificultades encontradas con la inestabilidad y administración de la secuencia no codificante crea dificultades en intentar proporcionar una dosis dentro de la célula recombinante que expresa la secuencia antisentido que puede modular eficazmente el nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos codificante diana.

Ha habido algunas mejoras en las tecnologías para modular el nivel de expresión génica dentro de una célula, tejido u organismo, y en particular, una falta de tecnologías desarrolladas para retrasar, reprimir o reducir de otro modo la expresión de genes específicos usando tecnología de ADN recombinante. Además, como consecuencia de la imprevisibilidad de estos enfoques, no están disponibles medios comercialmente viables para modular el nivel de expresión de un gen específico en un organismo eucariota o procariota.

Previamente se ha demostrado la inhibición mediada por ARN bicatenario de genes específicos en diversas plagas. Se han probado enfoques mediados por ARNb para el control genético en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster... [Seguir leyendo]

1. Una composición que contiene dos o más agentes pesticidas diferentes, cada uno tóxico para la misma plaga del gusano de la raíz del maíz, en la que el primer agente pesticida es una molécula de ARNb que funciona suprimiendo una función biológica esencial en una o más células de la plaga del gusano de la raíz del maíz, y en la que el segundo agente pesticida es una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha proteína insecticida de Bacillus thuringiensis está seleccionada de una Cr y 3, una TIC851, una Cr y ET70, una Cr y 22, una VIP, una TIC901, una TIC1201, una TIC407, una TIC417, una proteína insecticida binaria seleccionada de Cr y ET33 y Cr y ET34, Cr y ET80 y Cr y ET76, TIC100 y TIC101, y PS149B1, y quimeras insecticidas de cualquiera de las proteínas insecticidas precedentes.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho gusano de la raíz del maíz es una especie de Diabrotica, seleccionada preferentemente de Diabrotica virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental, WCR) , Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte, NCR) , Diabrotica virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mejicano, MCR) , Diabrotica balteata (gusano de la raíz del maíz brasileño, BZR) , Diabrotica viridula, Diabrotica speciosa y Diabrotica undecimpunctata howardii (gusano de la raíz del maíz del sur, SCR) .

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso en una célula de planta.

5. Un procedimiento para controlar una plaga del gusano de la raíz del maíz que comprende proporcionar en la dieta de la plaga del insecto dos o más agentes insecticidas tóxicos para la misma especie de insectos, en el que un primer agente insecticida comprende una molécula de ARNb expresada de una secuencia de ADN, en el que dicha molécula de ARNb inhibe una función biológica dentro de dicha plaga cuando es ingerida por dicha plaga, en el que una parte de dichas secuencias de ADN que consisten en al menos 21 nucleótidos contiguos presentan del 85% al 100% de identidad de secuencias de nucleótidos con una secuencia codificante seleccionada de SEC ID Nº: 1-143.

16. 174 y los complementos de las mismas, y en el que un segundo agente insecticida se proporciona junto con el primer agente insecticida en la dieta, en el que dicho segundo agente insecticida es como se define en la reivindicación 1 ó 2.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicha secuencia codificante derivada de dicha plaga está seleccionada de SEC ID Nº: 1-143 .

16. 174.