Composiciones y métodos para la recogida/transporte de un espécimen biológico.

Una composición para recoger y conservar una muestra de ácido nucleico que comprende:

a) uno o más caótropos;

b) uno o más detergentes;

c) uno o más agentes reductores;

d) uno o más quelantes;

e) uno o más tampones y

f) una molécula aislada de ácido nucleico monocatenario con una longitud de aproximadamente 60 a 500nucleótidos que comprende un segmento de ácido nucleico que:

(1) comprende un primer dominio de secuencia que se une específicamente a una sonda marcada con unalongitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 40 nucleótidos que es específica para la detección delsegmento de ácido nucleico;

(2) comprende un segundo dominio de secuencia que se une específicamente a un cebador directo deamplificación mediante PCR con una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos; y(3) comprende un tercer dominio de secuencia que se une específicamente a un cebador inverso deamplificación mediante PCR con una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos;donde los dominios de secuencia segundo y tercero están ubicados de forma operable para facilitar unaamplificación dirigida mediante PCR de al menos una primera porción del segmento de ácido nucleico a partirde los cebadores directo e inverso en condiciones eficaces para amplificar la al menos primera porción;donde la molécula no se une significativamente en condiciones de hibridación rigurosas a un genoma de unmamífero, o al genoma de una bacteria, hongo o virus que sea patógeno para un mamífero; yademás donde (a)-(e) están presentes en la composición en una cantidad suficiente para desnaturalizarproteínas, inactivar nucleases, destruir uno o más patógenos, y la composición no degrada sustancialmenteácidos nucleicos.

Composiciones y métodos para la recogida/transporte de un espécimen biológico

Campo de la invención La invención se refiere a composiciones y métodos para la recogida, transporte y almacenamiento de una muestra biológica que contiene una población de ácidos nucleicos, que pueden aislarse, purificarse y o caracterizarse posteriormente utilizando uno o más métodos o ensayos convencionales.

Antecedente de la técnica En el campo del análisis molecular y para diagnóstico, la capacidad de mantener ácidos nucleicos en una muestra biológica (y en particular, aquellos contenidos en muestras diagnósticas obtenidas de pacientes humanos) tanto si el 15 espécimen se recoge en una ubicación de campo remota, como en un consultorio médico o en un laboratorio, determina a menudo si los ácidos nucleicos se pueden analizar de manera satisfactoria. Los ácidos nucleicos de una muestra biológica se degradan y/o desnaturalizan rápidamente a temperatura ambiente y deben almacenarse generalmente a temperaturas de congelación para permanecer estables; sin embargo, se sigue produciendo algún grado de degradación en el tiempo. Este problema se ve aumentado cuando se recoge un espécimen en un sitio de campo remoto, o a una distancia significativa del consultorio médico o el entorno del laboratorio, y especialmente cuando el acceso a condiciones de enfriador/refrigerador/congelador consistentes y constantes hasta que la muestra se analiza, puede estar limitadas o no existir, tales como cuando el acceso a la energía eléctrica, o al equipo refrigerador/congelador es tanto no fiable, como inexistente. Los problemas asociados con la recogida y la manipulación de especímenes biológicos a partir de los cuales es deseable obtener ácidos nucleicos se agravan adicionalmente cuando los ácidos nucleicos deseados del análisis de la purificación incluyen ácido ribonucleico (ARN) , que es particularmente susceptible a la degradación por la actividad de la nucleasa endógena o exógena. Los métodos de transporte de especímenes utilizan a menudo medios de transporte especiales para las muestras biológicas para el transporte desde el punto de recogida hasta el punto de análisis, y en particular, un envasado que impone limitaciones sobre el tiempo que se puede almacenar una muestra, requiere un mantenimiento continuo de las muestras a bajas temperaturas, incluso durante el transporte o el almacenamiento extendido, y limita en la práctica el tiempo y las distancias posibles entre el sitio de recogida y el laboratorio diagnóstico.

Además de los riesgos relativos a la estabilidad del espécimen, existen a menudo riesgos adicionales con respecto a la manipulación y/o el almacenamiento de reactivos utilizados en el almacenamiento y el transporte de las muestras recogidas. Por ejemplo, los propios reactivos requieren con frecuencia temperaturas frías u otros cuidados especiales para mantener la estabilidad. Debido a estas características de estabilidad, por ejemplo, el transporte de los reactivos hasta un sitio de almacenamiento, el almacenamiento en el sitio de campo antes del uso, y el transporte de los especímenes y reactivos biológicos hasta un sitio de ensayo es un problema principal.

Otro riesgo significativo cuando se trabaja con especímenes biológicos es la inoculación, liberación, o diseminación potencial de agentes patógenos o biológicos infecciosos vivos procedentes del espécimen en el medio ambiente. Existen actualmente protocolos específicos que se emplean cuando se manipulan muestras que pueden ser infecciosas o representan cualquier otro riesgo para la salud o la seguridad. Si la muestra se mantiene viable y/o intacta biológicamente para conservar su integridad para el ensayo, los individuos implicados en el procedimiento de 45 recogida, transferencia, y ensayo están potencialmente expuestos a contagios muy peligrosos. Adicionalmente, espectadores inocentes próximos a un sitio de campo o de recogida de muestras (o próximos durante el transporte) pueden estar expuestos si se produce una liberación del contagio. Como resultado, las medidas de seguridad requeridas aumentan normalmente el gasto y el esfuerzo requeridos para mover dichas muestras desde una localización a otra.

Hasta hace poco, los métodos clínicos de laboratorio para la detección de patógenos eran métodos caros que requerían mano de obra y científicos con muchos conocimientos y expertos, con experiencia específica. La mayoría de laboratorios clínicos de diagnóstico empleaban el uso de métodos de cultivo tradicionales que requieren normalmente de 3 a 7 días para un cultivo vírico —e incluso lapsos de tiempo mayores para algunos otros agentes 55 bacterianos. Además, el cultivo tradicional requiere la recogida, el transporte y la propagación en laboratorio y la manipulación de agentes biológicos potencialmente infecciosos tales como Ébola, gripe aviar, síndrome respiratorio agudo severo (SARS) , etc.

El campo del diagnóstico clínico molecular cambió de forma drástica con la llegada de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la década de los ochenta del siglo pasado, sin embargo, poco después con la PCR en tiempo real a mediados de la década de los noventa del siglo pasado. Las plataformas de detección basadas en ácido nucleico que emplean, por ejemplo, ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) o PCR mediante transcriptasa inversa (RT-PCR) y PCR cuantitativa en tiempo real mediante transcriptasa inversa (qRT-PCR) pueden proporcionar resultados en horas frente a los días requeridos para los métodos de cultivo y aislamiento tradicionales 65 que convierten los métodos de detección molecular en el núcleo fundamental de los modernos análisis diagnósticos de laboratorio. Recientes mejoras en las químicas de detección, tales como flúores indicadores/inactivadores nuevos y mejorados, compuestos de unión al surco menor (MGB) (TaqMan MGB™, Applied Biosystems; para una referencia general, véase también, por ejemplo Baraldi y col., Pure Appl. Chem., 75 (2-3) :187-194, 2003) , y reactivos de amplificación estabilizados han sentado las bases de ensayos de detección de ácidos nucleicos más sensibles y muy específicos, y han demostrado ser más precisos, sólidos, y económicos que los anticuados métodos basados en cultivos celulares. Los avances en otras estrategias de detección de ácidos nucleicos tales como la amplificación mediada por transcripción, la reacción en cadena de la ligasa (LCR) y los así denominados ensayos multiplexados de tipo “laboratorio en un chip”, han contribuido también a la transición de viales de cultivo a micromatrices en el laboratorio clínico.

Algunas compañías comerciales (por ejemplo. Qiagen [Valencia, CA, EE:UU.], Roche Applied Science [Indianápolis, IN, EE.UU.], Gen-Probe [San Diego, CA, EE.UU.], y bioMérieux [Durham, NC, EE:UU:]) han desarrollado instrumentos para automatizar el procedimiento de extracción de ácido nucleico desde el aislamiento de la muestra hasta el análisis molecular. Por ejemplo, el Tigris DTS® ( (Gen-Probe, San Diego, CA, EE.UU.) automatiza el método de detección completo, y en 2004 fue aprobado por la U.S. Food and Drug Administration (FDA) para detectar de forma simultánea Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae utilizando el ensayo del test del ácido nucleico amplificado (NAT) mediante Gen-Probe’s APTIMA COMBO-2®.

Se ha divulgado el uso del bacteriófago MS2 como un control interno del ARN en los ensayos víricos de la PCR mediante transcripción inversa (Dreier y col., J. Clin. Microbiol 43 (9) : 4551-4557, 2005)

A la vista de los requerimientos de muestras de ácidos nucleicos de alta calidad en los sistemas actuales de detección y de ensayo, existe ahora una necesidad en la técnica de sistemas de recogida, almacenamiento y transporte seguros y fáciles que mantengan la integridad y la calidad de los ácidos nucleicos contenidos en una variedad de muestras y especímenes biológicos. Además, existe también ahora la necesidad de recoger, conservar

y transportar muestras (y particularmente aquellas que contienen organismos perjudiciales o patógenos) en localizaciones remotas o de campo en condiciones ambientales del entorno (es decir, no ideales) durante periodos largos de tiempo sin refrigerar, congelar, o manipular de otra manera especial el (los) reactivo (s) de recogida, la propia muestra biológica, o la población de ácidos nucleicos contenidos en la anterior. Además, existe ahora una necesidad de medios de recogida/transporte/almacenamiento menos caros y más convenientes que minimicen el riesgo de la exposición a patógenos de los trabajadores o transeúntes inocentes, que permitan el uso de formulaciones en una única etapa, y faciliten un transporte ambiente conveniente... [Seguir leyendo]

1. Una composición para recoger y conservar una muestra de ácido nucleico que comprende:

a) uno o más caótropos; b) uno o más detergentes; c) uno o más agentes reductores; d) uno o más quelantes; e) uno o más tampones y f) una molécula aislada de ácido nucleico monocatenario con una longitud de aproximadamente 60 a 500 nucleótidos que comprende un segmento de ácido nucleico que:

(1) comprende un primer dominio de secuencia que se une específicamente a una sonda marcada con una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 40 nucleótidos que es específica para la detección del 15 segmento de ácido nucleico;

(2) comprende un segundo dominio de secuencia que se une específicamente a un cebador directo de amplificación mediante PCR con una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos; y

(3) comprende un tercer dominio de secuencia que se une específicamente a un cebador inverso de amplificación mediante PCR con una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos; donde los dominios de secuencia segundo y tercero están ubicados de forma operable para facilitar una amplificación dirigida mediante PCR de al menos una primera porción del segmento de ácido nucleico a partir de los cebadores directo e inverso en condiciones eficaces para amplificar la al menos primera porción; donde la molécula no se une significativamente en condiciones de hibridación rigurosas a un genoma de un mamífero, o al genoma de una bacteria, hongo o virus que sea patógeno para un mamífero; y

además donde (a) - (e) están presentes en la composición en una cantidad suficiente para desnaturalizar proteínas, inactivar nucleases, destruir uno o más patógenos, y la composición no degrada sustancialmente ácidos nucleicos.

2. Una composición como se reivindica en la reivindicación 1, donde la composición no degrada sustancialmente el ácido nucleico cuando se almacena a una temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 40°C, durante un periodo de aproximadamente 1 día a aproximadamente 90 días.

3. Una composición como se reivindica en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, donde

a) cada uno del uno o más caótropos está presente en una cantidad de aproximadamente 0, 5 M a aproximadamente 6 M; b) cada uno del uno o más detergentes está presente en una cantidad de aproximadamente 0, 1 % a aproximadamente 1 % (peso/vol.) ; c) cada uno del uno o más agentes reductores está presente en una cantidad de aproximadamente 0, 5 mM a aproximadamente 0, 3 M; d) cada uno del uno o más quelantes está presente en una cantidad de aproximadamente 0, 01 mM a aproximadamente 1 mM; y e) cada uno del uno o más tampones está presente en una cantidad de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1 M.

4. Una composición como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la sonda marcada comprende al menos un primer compuesto de unión al surco menor, una etiqueta radioactiva, una etiqueta luminiscente, una etiqueta quimioluminiscente, una etiqueta fluorescente, una etiqueta enzimática, una etiqueta magnética, o una etiqueta de resonancia de espín; o una combinación de los mismos.

5. Una composición como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde

a) el uno o más caótropos comprende tiocianato de guanidina, isocianato de guanidina, clorhidrato de guanidina, o cualquier combinación de los mismos;

b) el uno o más detergentes comprende dodecilsulfato de sodio, dodecilsulfato de litio, tauodeoxisulfato de sodio, taurocolato de sodio, glicolato de sodio, desoxicolato de sodio, colato de sodio, alquilbencesosulfonato de sodio, N-lauroil sarcosina, o cualquier combinación de los mismos; c) el uno o más agentes reductores comprenden 2-mercaptoetanol, tris (2-carboxietil) fosfina, ditiotreitol, dimetilsulfóxido, o cualquier combinación de los mismos; d) el uno o más quelantes comprende ácido etilenglicol tetraacético, ácido hidroxietiletilendiaminetriacético, ácido dietilentriaminapentaacético, N, N-bis (carboximetil) glicina, etilendiaminotetraacético, citrato anhidro, citrato de sodio, citrato de calcio, citrato de amonio, bicitrato de amonio, ácido cítrico, citrato de diamonio, citrato amonioférrico, citrato de litio, o cualquier combinación de los mismos; o e) el uno o más tampones comprende tris (hidroximetil) aminometano, citrato, ácido 2- (N

morfolino) etanosulfónico, ácido N, N-Bis (2-hidroxietil) -2-aminoetanosulfónico, 1, 3-bis (tris (hidroximetil) metil amino) propano, ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazina etanosulfónico, ácido 3- (N-morfolino) propanosulfónico, bicarbonato, fosfato, o cualquier combinación de los mismos.

6. Una composición como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además uno o más de los siguientes:

g) uno o más tensioactivos seleccionados del grupo constituido por un polímero de silicona, un polisorbato, y cualquier combinación de los mismos; h) uno o más alcanoles de cadena corta seleccionados del grupo constituido por metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, o hexanol, y cualquier combinación de los mismos; y

i) uno o más agentes desespumantes seleccionados del grupo constituido por un polímero de silicona, un polisorbato, y cualquier combinación de los mismos; y cualquier combinación de los mismos.

7. Una composición como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que a) se ha tamponado a un pH de aproximadamente 6, 0 a 7, 0; b) está prácticamente exenta de actividad ARNsa o ADNsa; y c) comprende una población de polinucleótidos aislados de origen bacteriano, vírico o fúngico que comprende ARN, ADN, ANP, o cualquier combinación de los mismos.

8. Una composición como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la composición comprende:

a) tiocianato de guanidina aproximadamente 4 M; citrato de sodio aproximadamente 30 mM; aproximadamente 0, 25 % (peso/vol.) de docecilsulfato de sodio; aproximadamente 0, 25 % (peso/vol.) de N

lauroil sarcosina, sal sódica; (v) 2-mercaptoetanol aproximadamente 0, 1 M; y aproximadamente 0, 1 % de polímero de silicona (peso/vol.) ; b) tiocianato de guanidina aproximadamente 3 M; TCEP aproximadamente 1 mM; citrato de sodio aproximadamente 10 mM; aproximadamente 0, 5 % de N-lauroil sarcosina; aproximadamente 0, 0002 % de polímero de silicona; 2-amino-2-hidroximetil-propano-1, 3-diol (TRIS) aproximadamente 100 mM; y EDTA

aproximadamente 0, 1 mM; c) tiocianato de guanidina de aproximadamente 1 M a aproximadamente 4 M; TCEP de aproximadamente 0, 5 mM a 10 mM; citrato de sodio de aproximadamente 1 mM a 100 mM; SDS o NLS de aproximadamente 0, 1 % a aproximadamente 1 %; polímero de silicona de aproximadamente 0, 001 % a aproximadamente 0, 0001 %, TRIS de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, APCA, EDTA, EGTA, HEDTA, DTPA, NTA,

o citrato dé aproximadamente 0, 1 mM a aproximadamente 1 mM; y de aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 % de etanol (vol./vol.) ; o d) tiocianato de guanidina aproximadamente 3 M ; TCEP 1 mM ; citrato de sodio aproximadamente 10 mM ; aproximadamente 0, 5 % de N-lauroil sarcosina, sal sódica; aproximadamente 0, 0002 % de un polímero de silicona ; TRIS aproximadamente 100 mM ; aproximadamente EDTA 0, 1 mM ; y de aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 % de etanol (vol./vol.) .

9. Una composición como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la población de ácidos nucleicos se recoge y se conserva en un único recipiente de reacción que comprende la composición.

10, Una composición como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la muestra es una muestra biológica de origen clínico, veterinario, epidemiológico, ambiental, forense, o patológico; o donde contiene, o se sospecha que contiene, uno o más polinucleótidos de origen vírico, bacteriano, fúngico o mamífero.

11. Una composición como la de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula aislada de ácido 50 nucleico monocatenario, comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia:

12. Una composición como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso en diagnóstico,

tratamiento o terapia de una infección producida por microorganismos, bacterias, hongos o virus, uno o más síntomas de los mismos.

13. Un kit diagnóstico o sistema de recogida de muestra que comprende:

a) una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; e b) instrucciones para usar la composición en el diagnóstico o tratamiento de una infección por 5 microorganismos.

14. Un método para aumentar la eficacia de obtener una población purificada de polinucleótidos procedentes de una muestra biológica sospechosa de contener dichos polinucleótidos, que comprende: poner en contacto la muestra con una composición que comprende la molécula aislada de ácido nucleico monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en una cantidad y durante un tiempo suficientes para aumentar la eficacia de obtener la población purificada de polinucleótidos procedentes de una muestra biológica.

15. Un método como se reivindica en la reivindicación 14, donde la integridad de una población de polinucleótidos en la muestra biológica o la fidelidad de al menos una primera secuencia de uno de los polinucleótidos se mantiene al 15 menos sustancialmente cuando la composición que comprende la muestra se almacena a una temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 40°C (a) durante un periodo de aproximadamente 7 a aproximadamente 14 días; o (b) durante un periodo de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 días; y/o donde (a) la composición que comprende la muestra se almacena a una temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 40°C sustancialmente desde el momento de la recogida al momento de aislar, purificar o caracterizar una población de 20 polinucleótidos de la misma; o (b) menos de aproximadamente 5 % de la población de polinucleótidos contenidos en la muestra se degrada una vez que la composición que comprende la mezcla se almacena a una temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 40°C durante un periodo de aproximadamente 7 a aproximadamente 30 días; preferentemente donde la composición que comprende la mezcla se almacena a una temperatura de (a) de aproximadamente 10°C a aproximadamente 40°C durante un periodo de aproximadamente 24 a aproximadamente 96 h; o (b) de aproximadamente 10°C a aproximadamente 30°C durante un periodo de aproximadamente 7 días a aproximadamente 30 días.